pAdEasy-1/BJ5183 甘油菌（腺病毒重组配套菌）-上海雅吉生物科技有限公司

pShuttle-CMV-C-DsRed (腺病毒质粒, 红色荧光)是自行研发的用于构建表达C端DsRed(红色荧光蛋白)融合蛋白的重组腺病毒包装用的穿梭质粒。本穿梭质粒构建后，需要和预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)以及重组腺病毒包装细胞配合使用才能完成重组腺病毒的包装。

pShuttle-CMV-C-DsRed质粒可以用于在包装成腺病毒后表达C端含DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein，香菇珊瑚红色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的后面有一个DsRed的完整编码序列，因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达C端含有DsRed标签的融合蛋白。利用DsRed的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位，也可以利用DsRed抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。DsRed与GFP没有序列同源性，不能使用GFP抗体检测DsRed。

本质粒为卡那霉素抗性。

重组腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一种常见的用于在培养细胞或动物体内表达外源基因的重要工具。重组腺病毒具有感染宿主细胞范围广、感染不依赖细胞分裂、高滴度及目的基因表达水平高等特性。最常用的腺病毒载体是人类血清5型腺病毒。改造后的人类血清5型腺病毒，删除了在病毒装配过程中起关键作用的E1基因和非必须的能表达逃避宿主免疫的E3基因，E1和E3基因的删除使得重组腺病毒不能自我复制，同时给外源基因的插入提供了空间，最长可插入7.5kb的外源基因。从而提高了重组腺病毒的的安全性和可操作性。再利用携带E1基因的AD-293、293A、HEK293等细胞作为包装细胞就可以完成重组腺病毒的包装。

pShuttle系列的穿梭质粒携带外源目的基因，经过Pme I线性化，随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中，或者转化到已经预转化了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重组。BJ5183菌株表达recET基因，具有很高的基因同源重组(homologous recombination)活性，使带有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过末端反向重复序列同源重组，实现外源基因与腺病毒基因组的整合。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备获得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。

目的基因引入时不能含有Pme I及Pac I这两个酶切位点，如果含有该两个酶切位点的目的基因，需要对该位点进行突变方可进行基因操作。

pShuttle-CMV-C-DsRed主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
left inverted terminal repeat	1–103
encapsidation signal (ES)	183–331
CMV promoter	341–933
multiple cloning site	940–988
DsRed	993-1670
SV40 polyA	1690–1901
Ad5 right arm homology	1906–4160
Ad5 left arm homology	4208–5091
right inverted terminal repeat	4192–5194
pBR322 origin	5402–6069
kanamycin resistance ORF	6878–7669

pShuttle-CMV-C-DsRed 质粒(8155bp)的图谱如下：

pShuttle-CMV-C-DsRed质粒的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8115 pShuttle-CMV-C-DsRed.pdf。

pShuttle-CMV-C-DsRed 中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-DsRed)包括：

Acc65I	Afl II	Age I	Asc I	Asp718
Blp I	BsiC I	BsiW I	BstB I	Bsu36 I
Cla I	Eco72 I	EcoN I	Esp I	Fse I
Kpn I	Nru I	Pml I	Pvu I	Sfi I

pShuttle-CMV-C-DsRed 中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-DsRed once)包括：

SnaB I	TAC\|GTA	679	Sca I	AGT\|ACT	1683
Nhe I	G`CTAG,C	940	Hpa I	GTT\|AAC	1800
Not I	GC`GGCC,GC	945	BstX I	CCAN,NNNN`NTGG	3017
BamH I	G`GATC,C	952	Bst1107 I	GTA\|TAC	4173
Hind III	A`AGCT,T	958	Xca I	GTA\|TAC	4173
EcoR V	GAT\|ATC	966	Pme I	CTTT\|AAAC	4194
Sal I	G`TCGA,C	970	EcoR I	G`AATT,C	4199
Mlu I	A`CGCG,T	976	Avr II	C`CTAG,G	4741
PaeR7 I	C`TCGA,G	988	BspH I	T`CATG,A	6137
Xho I	C`TCGA,G	988	Psp1406 I	AA`CG,TT	6536
Stu I	AGG\|CCT	1204	Rsr II	CG`GWC,CG	7542
Xba I	T`CTAG,A	1672	Xmn I	GAANN \|NNTTC	8143
Spe I	A`CTAG,T	1678