冠状病毒Mpro/3CLpro活性荧光检测试剂盒(Coronavirus Mpro/3CLpro Activity Fluorometric Assay Kit)是一种用荧光法快速高灵敏检测冠状病毒主蛋白酶(main protease, 简称Mpro，也称3C-like protease，简称3CLpro)活性的试剂盒。

2019年底由新型冠状病毒引起的肺炎疫情，从2020年初开始在全球大流行，感染病例快速上升，引发全球关注。该病毒被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠状病毒导致的疾病，被世界卫生组织正式命名为冠状病毒疾病2019 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常称为新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”。

新型冠状病毒(2019-nCoV)属于单正链的RNA病毒，与SARS-CoV以及MERS-CoV具有较高的同源性，该病毒感染进入宿主细胞后，在宿主细胞的帮助下，其遗传物质RNA的ORF1a/b首先翻译表达出两条多聚蛋白前体(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前体在主蛋白酶(main protease, 简称Mpro)和木瓜样蛋白酶(papain like proteases)的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白。Mpro也被称为3C-like protease (3CLpro)，因为其切割位点的特异性与微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，两者并称为Mpro/3CLpro。多聚蛋白前体产生的非结构蛋白参与了病毒亚基因RNA和四个结构蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的产生，进而完成子代病毒的繁衍与释放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至关重要的作用，且人体内没有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点。

2019-nCoV Mpro/3CLpro与SARS-CoV Mpro/3CLpro只差12个氨基酸，同源性大于96%，两者结构基本一致，本试剂盒中使用的阳性对照2019-nCoV Mpro/3CLpro是采用自主研发的PerfectProtein™蛋白表达技术平台纯化而来，使表达的重组2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白没有任何额外的标签，没有任何一个额外的氨基酸，确保与2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致，便于检测体系的建立和酶活的比较。

冠状病毒Mpro/3CLpro活性检测试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物(Substrate)，即MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (P9731)的两端。当Mpro/3CLpro蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA荧光而检测不到荧光；当该底物被Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。本试剂盒的检测原理请参考图1。

图1. 冠状病毒Mpro/3CLpro活性荧光检测试剂盒检测原理图。

本试剂盒内提供了MCA标准溶液，MCA标准品在0.2-50μM范围内有良好的线性关系。可以通过设置标准曲线，计算出样品中Mpro/3CLpro蛋白酶的活性。

本试剂盒可以检测不同类型样本的冠状病毒Mpro/3CLpro酶活力，包括新冠病毒、含新冠病毒的细胞或动物组织、表达Mpro/3CLpro酶的细胞或组织裂解液或纯化的Mpro/3CLpro酶等。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装P0313S可以进行100次检测，本试剂盒中包装P0313M可以进行500次检测。

包装清单：

保存条件：

-20℃保存，一年有效。其中P0313-3 Substrate和P0313-4 MCA Standard (10mM)需避光保存。

注意事项：

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则可能会影响检测结果。2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml)的使用应在冰上进行。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

请确保样品pH值在7-8之间，或加入样品后反应体系的pH值在7-8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。

待测样品裂解液是指裂解和稀释待测样品所用的裂解液，即病毒裂解液或含病毒的细胞、组织裂解液的稀释液，该溶液可能会对检测产生干扰，推荐用本试剂盒提供的Assay Buffer为溶剂稀释待测样品。体积较少的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.试剂盒的准备：
融解Assay Buffer、Substrate和MCA Standard并平衡至室温，轻轻混匀后Substrate和MCA Standard略离心使溶液积聚于管底。使用完毕后宜立即-20℃保存。
2.阳性对照的准备。
根据实验目的或者参考图2B取适量的2019-nCoV Mpro/3CLpro稀释至一定的浓度。例如取1μl 2019-nCoV Mpro/3CLpro (1mg/ml )，加入19μl Assay Buffer，混匀，即得50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro。反应体系中若加入10μl 50μg/ml的2019-nCoV Mpro/3CLpro，则2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白量为0.5μg。
3.MCA标准曲线设置：
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混匀，即为200μl 100μM的MCA溶液，分别取0、0.5、1、2、4、6、8、10μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer补足至100μl，此时，MCA标准曲线的各孔MCA分别为0、0.5、1、2、4、6、8、10μM或0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1nmol。也可自行设置各孔MCA浓度进行标准曲线的设定。
4.检测体系的设置：
参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可以稀释一系列浓度梯度，确保最终检测值在标准曲线线性范围内。待测样品的稀释倍数记为dil。

注1：待测样品裂解液是指用于裂解和稀释待测样品所用的溶液，即病毒裂解液或含病毒的细胞、组织裂解液的稀释液。
注2：为获得更加可靠的检测结果，推荐每个样品设置3个复孔。
5.检测：
a.振荡混匀1-2分钟，确保混合充分。
b.除MCA标准品孔外每孔加入2μl Substrate，混匀。注：加入Substrate后反应会立即开始，如果孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入Substrate的时间差而导致的误差，混匀操作可在培养板振荡器上进行。
c.混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为325nm，发射波长为393nm。每1分钟读取一次数值。
注1：连续测定的时间可以根据待测样品中Mpro/3CLpro的酶活性进行调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于Mpro/3CLpro的酶活较高的样品，建议测定总时间为5分钟或10分钟，对应的测定间隔时间设为30秒或1分钟；对于Mpro/3CLpro的酶活很低的样品，可以延长测定总时间为10、15或者20分钟，对应的测定间隔时间设为2、3或4分钟。也可以连续测定20分钟，每隔1分钟测定1次。
注2：本试剂盒中的2019-nCoV Mpro/3CLpro活性较高，反应较为迅速，约5分钟已经反应完全。
注3：如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的酶偏低的程度会有所不同。
6.计算：
a.计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU阳性对照和RFU待测样品。RFU，Relative Fluorescence Unit。选取待测样品组MCA荧光强度呈线性关系的时间点的数据用于分析，记录呈线性关系的时间间隔为T，时间间隔T内的荧光强度变化量为ΔRFU，即ΔRFU= RFU待测样品(Time b) - RFU待测样品(Time a)。
b.也可以直接比较各个样品在一定时间内的ΔRFU而确定样品的Mpro/3CLpro相对活性，但须确保最终时间点时RFU读数未达平台。
c.也可将标准曲线各孔的荧光值减去标准品零浓度孔的荧光值，建立MCA标准曲线。将ΔRFU代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中MCA的生成量(记录为A)。MCA的标准曲线请参考图2A，MCA在0-1.3nmol范围内有良好的线性关系。Mpro/3CLpro蛋白酶活性的计算公式如下：
Mpro/3CLpro Activity (nmol/min/ml或mU/ml)= A × dil/ (Vsample × T)
注：Vsample 为检测时待测样品的体积(Vsample=10μl=0.01ml)
dil为步骤4中稀释倍数
T为步骤6a中反应时间(min)
A为步骤6c中根据标准曲线计算得的MCA产物量(nmol)
酶活力单位U (Unit)的定义为：在pH7.0，温度37℃条件下，每分钟催化生成1μmol MCA-AVLQ的酶量定义为一个单位。本试剂盒中提供的2019-nCoV Mpro/3CLpro的酶活力≥300U/g (即≥300μmol/min/g)。
图2. 冠状病毒Mpro/3CLpro活性荧光检测试剂盒的MCA标准曲线和2019-nCoV Mpro/3CLpro阳性对照检测效果图。本试剂盒的MCA标准品的标准曲线示意图见图A。不同量的2019-nCoV Mpro/3CLpro酶切底物生成产物的荧光强度示意图见图B。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。​