产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
产品及特点规格及成分
即用型PCR 试剂盒 3.0是在本公司即用型PCR 试剂盒2.0 的基础上改良而来，内含Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料（对A 型）等所有PCR 所需要的成分,具有广泛的用途。本产品具有下列特点：,
1. 方便，用户只需准备模板和引物即可以进行PCR 实验。
2. 产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3. 扩增效率和灵敏度更高。
4. 本产品 A 型含电泳染料,PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。
5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。
6. 本产品足够50 次40 mL 体系的常规PCR。
7. 本产品只供科研使用。
本产品A 型（90805A）中直接加入了专用染料，PCR 后可以直接上样电泳。
本产品B 型（90805B）中没有加入专用染料，客户需要加上样液后才可上样电泳。
即用型PCR 试剂盒低温运输，-20℃保存, 有效期一年。
DNA 模板、引物、超纯水。
以30 mL 的标准PCR 反应体系为例：在一干净的PCR 管中，加入下列成分：
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| 补水到 | 30 mL |
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| 放入PCR 仪中进行PCR, 结束后取 5-10 mL 直接上样电泳（对A 型产品，如果是 B型产品，则需要额外再加 DNA 上样液后才能电泳）, 红色染料电泳速度相当于 50 bp DNA 片段。
注意： 1. 如果反应体系不是 30 mL，各成分需要等按比例增加或减少。 2. 如果 DNA 模板中有 PCR 不明抑制物（植物、土壤和血液等 DNA 样品常含此类抑制物），可以在 PCR 体系中加入 1/10 的 PCR 抑制物清除剂（CAT#：60804， 30mL 体系中加 3mL），可能会对 PCR 有帮助。 | ||||
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即用型PCR 试剂盒相关资料 |
PCR 反应的影响因素 变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全， DNA 双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为 94℃ 20~30 秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热 DNA 聚合酶的活力， 最高变性温度不宜超过 95℃。 退火温度与时间：退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板 错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引 物的熔解温度 Tm 低 5℃，退火时间一般为 30~60 秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。 延伸温度与时间：PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间，延伸时间根据所用 聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增 2 Kb 片段，若使用 Taq 酶只需 1 分钟，使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。 循环次数：可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设 定 20-40 个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加， 非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。 酶量：50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶，酶量的选择与模板DNA 的量，扩增片段大 小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高 保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。 | |||
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| 模板：模板可以是单链 DNA，也可以是双链 DNA，质粒 DNA 的扩增效率略低于线状 DNA。模板加量一般不需太多，不超过 1 μg 为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。 引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳 长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几个碱基，有利 于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个 引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结 构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有GC，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM 左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。 |
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关联产品 | PCR Inhibitor Erasol (CAT#:60804)。即用型PCR 试剂盒 |
