由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理 100mg 左右的各种组织，可以在 1.5 mL 塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于微量提取的量进行，最后再收集在一起。
1. 新鲜配制裂解液。将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液 A 和溶液 B 混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每 10 平方厘米细胞中加入 1mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每 1-5×106 悬浮细胞中加入
1mL 新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts 或 carcinomacell，1mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过 1×106 个细胞。c)对新鲜的动物或植物实体组织：匀浆法：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入 10mL 或 15mL 塑料离心管中，每 50-100mg 组织加 1mL
新鲜配制的裂解液，用剪切式匀浆机匀浆 30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的 DNA），建议组织的使用
量不要超过 50mg/mL 裂解液，否则十分容易产生 DNA 污染。液氮研磨法：将组织在液氮中研磨成粉，然后转移到新配制的裂解液中，震荡混匀。d)对在 RNALOCKER 等非冻型保存液中保存的动物或植物实体组织组织：先用纸吸去 RNALOCKER 液体后再剪切成小块，再按新鲜实体组织的处理
方法处理。
2. 将裂解物转移至一个干净的 1.5mL 塑料离心管中，然后加入 0.2 倍体积的自备氯仿(1mL 裂解物需 0.2ml 氯仿)，振荡器上充分振荡混均 30 秒。
3. 12000-15000g 室温离心 3-5 分钟。
4. 将上清液（约 0.6-0.8mL）转移到离心吸附柱中。注意：离心后下层有机相和中间层含有 DNA 和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。
为保险起见，可以留下 100uL 上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状 DNA。
5. 12000-15000g 室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA 将与离心吸附柱的膜结合，小 RNA 将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的最大吸附能力为 40ug 动物 RNA，20ug 植物 RNA，所以如果样品中的大 RNA含量高于上面数值，则需要减少上样量，否则穿透液中将同时含有大 RNA 和小 RNA。如果不减少上样量，也可以将穿透液再次重复上柱以去除大 RNA。
由于此时离心吸附柱已经吸附了大 RNA，所以需要提前对离心吸附柱进行预处理（具体步骤见本手册最后的附录）。
6. 在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等体积的溶液 C，混匀。此时溶液的总体积约 1.5mL。
7. 先转移约 0.75mL 到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
9. 加 0.7mLmiRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分钟，弃穿透液。
10.加 0.3mLmiRNA 专用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000g 室温离心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000-15000g 室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留的 miRNA 专用洗柱液会影响 miRNA 的使用。
12.将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 收集管中，加入 30-50uLRNA 洗脱液，室温放置 3-5 分钟。
13. 12000-15000g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 miRNA 样品，可以立
即使用或存放于-80℃待用。
附录：离心吸附柱反复上样去除大 RNA 的流程
1. 将结合有大 RNA 和 DNA 的宽口离心吸附柱中加入 0.1mL 自备的超纯水，12000-15000g 室温离心半分钟，弃收集液。
2. 再加 0.1mL 自备的超纯水，重复上步一次。
3. 将第 5 步的得到、需要进一步去除其中大 RNA 和 DNA 污染的穿透液直接上柱，12000-15000g 室温离心半分钟，收集穿透液（此穿透液含小 RNA）。
4. 如果大 RNA 已经去干净，可以直接进入第 6 步。一般样品只需要额外处理一次就可以去除全部的大 RNA 污染。
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