产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
| 产品及特点 | 大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌（Escherichia coli），属于革兰氏阴性细菌。 | ||||
| 大肠杆菌 O157:H7 是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia | |||||
| coli, EHEC)的最常见类型，O 表示抗原类型, H7 表示血清型。其感染剂量极低， | |||||
| 人体只要摄入 10 个细菌就可以致病，目前还没有特效疫苗，因此大量开展预防 | |||||
| 检测工作具有重要的意义。目前对 O157 的检测主要是传统分离培养、免疫学 | |||||
| 和分子水平的 PCR 检测。本试剂盒就是利用实时荧光定量 PCR 技术开发的大 | |||||
| 肠杆菌 O157:H7 检测试剂盒，它通过荧光染料实时显示样品模板 DNA 的量， | |||||
| 并通过坐标曲线表示出来，结果直观准确。它具有下列特点： | |||||
| 1.即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。 | |||||
| 2.荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。 | |||||
| 3.本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 | |||||
| 规格及成分 |
| 成分 | 编号 | 50 次塑料袋包装 |
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| 2×qPCR Mix | 90408 | 1.0 mL | |||
| O157:H7 专一性引物对 | yw13851386 | 200 μL | |||
| O157:H7 阳性对照， XXX 10E9 拷贝/μL |
yw13871388 |
100 μL | |||
| 超纯水 | 100935 | 1 mL | |||
| 使用手册 | 1 份 | ||||
| 运输及保存 | 低温运输，-20℃保存，保存期限一年。 | ||||
| 自备试剂 | 样品等 | ||||
| 使用方法 | 一、样品 DNA 的制备 | ||||
| 用自选方法提取细菌样品 DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的 | |||||
| 关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检 | |||||
| 测灵敏度。 | |||||
| 二、制备 O157:H7 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标 | |||||
| 准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样 | |||||
| 品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品 | |||||
| 不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DNA 片段 | |||||
| 作为阳性对照。 | |||||
| 1.标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。 | |||||
| 2.用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。 | |||||
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| 3.先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到 | ||||
| 10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7 | |||||
| 拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。 | |||||
| 4.在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 O157:H7 阳性对照(上步稀释所 | |||||
| 得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。 | |||||
| 5.换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5 | |||||
| 拷贝/μL 的阳性对照。 | |||||
| 6.换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6 | |||||
| 个稀释度的阳性对照。 | |||||
| 7.NC 管中不加任何阳性对照。 | |||||
| 8.从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个 | |||||
| 样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值， | |||||
| 并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。 | |||||
| 三、PCR 检测（20 μL 体系） | |||||
| 1.在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次）： | |||||
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注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR | |||||
| 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 | |||||
| RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。 | |||||
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2.建议 PCR 反应参数（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化） | |||||
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| 过程 | 温度 | 时间 |
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| 预变性 | 95℃ | 10 min | |||
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| PCR 反应 （40 个循环） | 94℃ | 15 s |
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| 60℃ | 30 s | ||||
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3.数据采集 | |||||
| 具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 | |||||
| DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm， | |||||
| 最大发射光谱在 530 nm。 | |||||
| 四、数据处理 | |||||
| 以 O157:H7 阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲 | |||||
| 线。再以待测样品浓度的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值 | |||||
| 计算出样品 DNA 的浓度。 | |||||
| 关联产品 | 鹦鹉热衣原体荧光定量 PCR 检测试剂盒（CAT#:11-3780） | ||||
