产品及特点

施马伦贝格病毒（Schmallenberg Virus，SBV）是一种RNA病毒，是一种正本雅病毒属的新病毒，感染症状为发热、腹泻、乏力等，感染此病毒的奶牛产奶量降低，以及新生幼畜出现缺陷等。目前还没有发现它能感染人的证据，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测施马伦贝格病毒的试剂盒。

它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据施马伦贝格病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒

RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

规格及成分

成分

编号

十孔盒包装

探针法qRT-PCR缓冲液

190504a

500 μL（蓝盖）

探针法qRT-PCR酶混合液

190504b

100 μL（红盖）

荧光PCR 专用模板稀释液

180701

1 mL（黄盖）

施马伦贝格病毒探针法qRT-PCR 引物混合液

15-90300yw

100 μL（白盖）

施马伦贝格病毒qRT-PCR 探针

15-90300pb

50 μL（棕色管）

施马伦贝格病毒探针法qPCR阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)

60908-90300pc

50 μL（黄盖）

使用手册

15-90300sc

1 份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂

样品 RNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震

荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入5μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得1×10E6 拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用

5. 换枪头，在 5 号管中加入5μL 1×10E6 拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性

对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA 提取试剂盒兼容。也可以向我公司购买柱式病毒RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设  置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加）

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

标准曲线

样品管（2-7 管）

探针法qRT-PCR缓冲液

各10μL

10μL

各10μL

探针法qRT-PCR酶混合液

各2μL

 2μL

各2μL

施马伦贝格病毒 qPCR 探针

各1μL

1 μL

各1μL

施马伦贝格病毒探针法 qPCR 引物混合液

各2μL

2 μL

各2μL

待测样本 RNA 模板

5 μL

-

-

超纯水

-

5 μL

-

第 7 步所得标准曲线样品稀释液

（2-7 号）

-

-

 各5μL（2 号样到

2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

4. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于35，则为阳性。

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