肠道是我们熟知的重要消化器官,主要执行消化 吸收 排毒功能,事实上肠道也是机体最大的免疫器官,还具有免疫防卫和神经调节功能.那么肠道是如何执行免疫功能的呢？首先,我们要知道肠道的免疫功能是由黏膜免疫系统执行的.黏膜免疫系统与外部世界密切接触,包括微生物群 病原体和环境抗原,这需要对免疫反应进行微调,使对病原体的有效反应,同时保持对无害刺激的耐受性.粘膜免疫系统有机体70%以上的免疫细胞,如巨噬细胞 T细胞 NK细胞 B细胞等,集中在肠道,有70%以上的免疫球蛋白A,由肠道制造,用来保护肠道.

 

 

                                                                图1 小鼠肠黏膜免疫系统构成

 

      粘膜肠上皮细胞由单层肠道上皮细胞组成,它们对营养吸收至关重要,并为有害物质提供屏障.在粘膜单层柱状上皮细胞之间 粘膜上皮细胞的基底膜上,存在着上皮淋巴细胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）.平均每100个肠上皮细胞之间就有10-20个IEL,80%以上的IEL为CD8+T淋巴细胞；IEL能以非MHC限制的方式直接识别未加工的抗原并发挥溶细胞活性,是机体早期抗感染的重要方式.

 

 

 

      IEL可以根据TCR受体的表达谱分为以下几类：TCRab TCRgd TCR-,具体分类见下图：

 

 

（1）脱颈处死小鼠,喷适量酒精于腹部,开腹暴露肠道.（2）滴适量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）润湿腹腔,将肠道整体向上推翻,找到直肠.由直肠至胃,自下而上分离肠管和系膜等结缔组织.剪取胃下至回盲部上端的小肠,两次对折浸入 5 mL Buffer1中.（3）小肠放入培养皿内并等分.在 Buffer 1 润湿的擦拭布上除去脂肪和淋巴结并剖开.在含有Buffer 1的培养皿中依次清洗小肠,清洗干净后将小肠剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中.（4） 取材全部结束后,每管加入 1 mM DTT,摇床 37℃,200 rmp,消化 20 min.（5）消化结束后再次离心,4℃,600 rmp,瞬离 30 s.其目的是使未消化彻底的组织沉淀在底部,保证过滤顺畅.离心结束后用 100 μm 滤网并收集上清.（6）剩余组织每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）继续消化.摇床 37℃,200 rmp,30 min.（7）第二次消化结束后先用涡旋仪剧烈地漩涡两次,再次离心,4℃ 600 rmp,30 s.（8）收集两次消化获得的上清混匀并进行 4℃离心,2000 rmp,4 min.（9）每管加入10 mL 44%的分离液,离心,2000 rmp,20 min升6降0.（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍,4℃,1500 rmp,5 min,弃上清.此时获得的细胞即为我们所需的肠上皮淋巴细胞.

 

 

                              图3 小鼠回肠解剖方法展示

 

 

 

                         小鼠肠上皮淋巴细胞纯度及亚群鉴定

 

 

图 4 小鼠肠上皮淋巴细胞分离后细胞纯度及活性鉴定

 

 

 

      上文我们已经展示了小鼠肠上皮淋巴细胞IEL的分类,下面我们用流式细胞术详细展示各亚群的圈门策略.小鼠小肠中提到的IEL亚群一般为TCRγδ+ CD4-CD8αα+ （TCRγδCD8αα）, TCRαβ+CD4-CD8αα+ （TCRαβ CD8αα）, TCRαβ+ CD4-CD8αβ+（TCRαβ CD8αβ）, TCRαβ+ CD4+CD8α-（TCRαβ CD4） 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ （TCRαβ DP）. TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被认为是组驻留记忆T细胞,在抗原暴露后会迁移到上皮细胞,相反,前两种亚型通常被认为是非传统的或者先天T细胞,它们直接从胸腺迁移到肠上皮或者经历选择性原位扩张后,组成性地填充肠上皮.

 

 

                                              图 5 小鼠肠上皮淋巴各亚群细胞圈门策略

 

 

 

                                                    小鼠肠上皮淋巴细胞的体外培养

 

 

 

      IEL单独体外培养很容易死亡,IL-15可以短期内维持其活性,而IL-15/IL-15R复合体更加有效.如果需要长期培养,则需要在有多种细胞因子的情况下进行TCR刺激.

 

 

短期培养：

 

细胞铺板,106细胞重悬于96孔板中,并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R复合物重组蛋白使其终体系为200μL.37 ℃二氧化碳培养箱中可维持1-3天.

 

   长期培养：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圆底板上（1μg/mL,每孔50μL）, 37℃ 孵育2小时或4℃ 过夜包被.然后用无菌PBS洗涤3次.（2）将IEL以5×105/ml重新悬浮96孔板中,并加入以下细胞因子：IL-2（10 IU/mL） IL-3（100 IU/mL） IL-4（100 IU/mL）,IL-3（100 IU/mL）,IL-4（100 IU/mL）,和可溶性的IL-15（100 ng/mL）.（3）200μL体系,37 ℃二氧化碳培养箱中培养48h.（4）洗涤细胞两次,1×105每孔重悬于含IL-2（10 IU/mL）的培养基中.（5）每隔3-4天更换新鲜的含IL-2的培养基.

 

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