细胞描述：
小鼠胚胎干细胞.该细胞缺乏 HGPRT（HPRT）,并且对 0.06 mM 的 6-硫鸟嘌呤有抗性.当在饲养层（胚胎成纤维细胞或 STO 细胞）上培养时,细胞保持未分化状态.在没有饲养层的情况下,细胞自发分化并形成胚胎结构.当注入胚泡中时,细胞可以进入生殖系.在常规的分子基因修饰技术之后,它们可用于重构小鼠胚胎.培养时需使用昆明白MEF作为饲养层细胞.
细胞特性
1） 来源：小鼠,129/Ola品系,胚胎内细胞团
2） 形态：球形克隆 贴壁生长
3） 含量：>1x106 细胞数
4） 规格：1mL冻存管包装
5） 用途：仅供科研使用
运输和保存：干冰运输：1mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净 冻存管瓶盖脱落 破损及细胞有污染,请立即与我们联系.
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM 基础培养基 (0001) 81%
优质胎牛血清 （0500） 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 ( 0900 ) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (01000) 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸钠 ( 01100 ) 1%
P/S青霉素-链霉素 （15140-122） 1%
β-巯基乙醇 (8211) 0.5 mL（1000X)
LIF (50756) 5μg（10ng/mL）
使用昆明白MEF作为饲养层细胞.
2）培养条件： 气相：空气,95%；二氧化碳,5%. 温度：37℃,培养箱湿度为70%-80%.
3）冻存液：完全培养液 60%%,FBS 30%%,DMSO 10%%现用现配.
我库冻存时,体积为 500 μl,预期存活率 70%,每支冻存管的细胞复苏,3 至4 天后,会形成 30 至 40 个克隆,建议复苏至 1 个 T25 培养瓶中.
二：细胞处理：
MEF 细胞铺制：
1. 在 T25 培养瓶中加入 0.2%明胶,摇匀后覆盖底面即可,于 37℃细胞培养箱至少放置 15 min 以上.
2. 吸除 0.2%明胶,加入事先水浴加热至 37℃的 MEF 完全培养液.一般地,一个 T25 培养瓶中加入 5 ml MEF 完全培养液.
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；复苏 MEF 细胞若干支.将冻存管从液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染.
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含 2 ml MEF 完全培养液的 15 ml 离心管内,以1000 rpm,离心 5 min,离心后将上清液吸除,另加入新鲜的 MEF 完全培养液 1 ml,重悬后按照一个 T25 培养瓶铺 1´106 的 MEF 细胞,平均加入到 T25 培养瓶中,轻轻摇匀后置于 37℃细胞培养箱.24 h 以后可以传入小鼠胚胎干细胞.
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞前,将 T25 培养瓶中的 MEF 完全培养液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除,加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液待用.
复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞冻存管从液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用 75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染.
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液的 15ml 离心管内,以 1000 rpm,离心 5 min.
3. 离心后将上清液吸除,另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞完全培养液 2 ml,吹打悬浮.
4. 重复吹打,制成单细胞悬液,尽量避免气泡.
5. 转移至 1 个已经铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中培养.
6. 每天更换小鼠胚胎干细胞完全培养液.
传代：
1. 一般在复苏后第 2-3 天传代,视克隆大小和密度而定
2. 吸除废液.
3. 用 PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍.
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培养瓶,轻轻晃动,使胰酶覆盖底面,置于 37℃培养箱内消化细胞.
5. 在显微镜下观察,直至细胞层全部脱落（一般需要 1-2 min）.
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液终止消化.
7. 以 1000 rpm,离心 5 min,弃上清.
8. 加入约 1 ml 小鼠胚胎干细胞完全培养液,多次轻轻吹打细胞, 制成单细胞悬液.
9. 加入足量的小鼠胚胎干细胞完全培养液,吹打混匀,细胞悬液分装到铺好 MEF 细胞的 T25 培养瓶中.一般地,一个 T25 培养瓶加入 5-6 ml 培养液.放入 37℃培养箱内培养.每天换液.
传代比例：1:4-1:7
冻存：
1.按传代的方法将细胞消化下来,制成细胞悬液.
2. 以 1000 rpm,离心 5 min,弃上清,逐滴加入已经预冷的冻存液,悬浮细胞.
3. 按每支存管内加入 500 ml 细胞悬液分装到冻存管内,标记细胞名称 代数 冻存日期等基本信息.
4．将冻存管置于程序降温盒内,-80℃过夜,转入液氮.
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液 60%,ES 级 FBS 30%,DMSO 10%
小鼠胚胎干细胞E14培养说明书
附：小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞,按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后,加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞, 吹打混匀,细胞悬液分装到无 MEF 细胞的培养皿或培养瓶（一般地,一个T25 培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞,在一个 10 cm 培养皿中进行差速贴壁.不要事先铺明胶,如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与 MEF 细胞）中.
2. 培养皿或培养瓶置于 37°C 培养箱内静置 1 小时.
3. 1 小时后,绝大部分 MEF 细胞已贴在培养皿或培养瓶底面,而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中.收取培养液,进行后续实验.
注意事项：
1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内操作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃.
2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套 衣服和戴上防护面罩.注意：冻存管浸没在液氮中会泄漏,并会慢慢充满液氮.解冻时,液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子,从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害.
