试剂盒组份：

组份	规格
变性细胞裂解液	25mL
离心管柱	50 个
收集管	50 个
塑料研磨棒	2 根

产品说明：

动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒,是新一代超快速蛋白质提取工具.越来越多的证据表明最常用的 RIPA 缓冲液可能导致蛋白质的随机损失,产生很多难以解释的疑难数据.本试剂盒使用离心管柱提取技术结合优化的裂解缓冲液可以更快速更有效地提取总蛋白,使 WB 结果更加准确.使用离心管柱提取蛋白,提取体系最低可以低至 20μL,有效的解决了小样本量的样本.

知识点：

1. 蛋白酶抑制剂不是必须加入,但是如果下游实验需要较长时间或者蛋白提取后保存较长时间, 建议添加蛋白酶抑制剂.推荐使用 BCA 试剂盒用于蛋白浓度测定.研究蛋白磷酸化,磷酸酶抑制剂应在使用前加入裂解缓冲液.

2. 做 WB 上样前,仍需和 loading buffer 混匀煮制样品.

动物组织/细胞总蛋白提取试剂盒操作方法：

细胞样品总蛋白提取

A. 非贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷.

2. 低速离心收集细胞,在 1.5ml 离心管中加入预冷的 PBS,旋窝震荡,500g 离心 2-3 分钟清洗细胞.吸去上清,剩余与细胞体积相同体积的 PBS.涡旋震荡重悬细胞.

3. 加入表格 1 中相应体积的细胞裂解液,涡旋震荡裂解细胞.（细胞数量和裂解液须保证对应关系,以达到最佳提取效率）请注意：部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量.

4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000g 离心 30 秒取出.

5. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验.

表 1. 不同细胞体积应加入相应体积裂解液

细胞体积（μL）	裂解液（μL）	相当细胞量 X 106
3	20	0.3
5	50	0.5
10	100	1
20	200	2
40	500	3

B. 贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板,培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞,吸去上清.

3. 按照表 2 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面,用移液器吹打几次,将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000g 离心 30 秒取出.（如提取浓度不佳,可减少裂解液使用量）

4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验.表格 2. 不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

动物组织总蛋白提取

以下步骤是从 15-20mg 组织中提取.如果起始量较大或者较小,需调整相应裂解液的用量比例.

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2. 将 15-20mg 组织放置于离心管柱上,用塑料棍扭转研磨 50-60 次,加入 200μL 细胞裂解液, 继续研磨 30-60 次.（组织用量不要过量,无需过度研磨,裂解液可分两次加入以得到最佳效果）

注意：塑料研磨棒可以重复使用,用蒸馏水彻底冲洗干净,用纸巾擦干.

3. 盖上盖子室温孵育 1-2 分钟,14000-16000g 离心 1-2 分钟取出.收集管里的上清是抽提的变性总蛋白.

请注意：部分未完全裂解的组织不会影响样品质量.

常见问题

问题	解决方案
裂解物太粘稠,无法用 200-1000µL 吸头吹打	将细胞裂解物倒入离心管柱中或将吸头剪掉尖端
离心 30 秒后离心管中还存留细胞裂解液	减少起始细胞/组织的数量或增加细胞裂解液
低蛋白浓度	增加起始细胞/组织的数量或减少细胞裂解液量
高分子量范围（100-300KDa）蛋白条带弱	增加细胞裂解液确保细胞/组织裂解充分