1 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测组织 血清 蜂蜜 牛奶 尿液 蛋类等样本中的磺胺类药物（Sulfonamides,SAs）,试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板 酶标记物 抗体 标准品及其他配套试剂组成.检测时,加入标准品或样本溶液,样本中的磺胺类药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗磺胺类药物抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样本吸光度值与其所含磺胺类药物含量成负相关,与标准曲线比较即可得出样本中磺胺类药物的残留量.
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb（ng/ml）
2.2 反应模式：25℃,45min～15min
2.3 检测下限：
组织（高检测限方法）……………0.5ppb
组织（低检测限方法）……………2.5ppb
血清 尿液…………………………2ppb
蜂蜜…………………………………0.5ppb
牛奶…………………………………10ppb
水样 蛋类…………………………1ppb
2.4 交叉反应率：
| 药物名称 | 交叉率 | 灵敏度ppb |
| 磺胺二甲基嘧啶（SM2） | 100% | 0.5 |
| 磺胺间甲氧嘧啶（SMM） | 670% | 0.07 |
| 磺胺对甲氧嘧啶（SMD） | 582% | 0.09 |
| 磺胺邻二甲氧嘧啶（SDM＇） | 451% | 0.1 |
| 磺胺甲基嘧啶（SM1） | 313% | 0.15 |
| 磺胺嘧啶（SD或SDZ） | 308% | 0.15 |
| 磺胺二甲异嘧啶（SM2＇） | 241% | 0.2 |
| 磺胺间二甲氧嘧啶（SDM） | 175% | 0.3 |
| 磺胺甲噻二唑（SMT） | 165% | 0.3 |
| 磺胺脒（SG） | 131% | 0.8 |
| 磺胺氯吡嗪（Esb3） | 67% | 0.8 |
| 磺胺噻唑（ST） | 58% | 0.9 |
| 磺胺氯哒嗪（SCPA） | 58% | 0.9 |
| 磺胺甲氧哒嗪（SMP） | 57% | 0.9 |
| 磺胺喹噁啉（SQX） | 42% | 1 |
| 磺胺异噁唑（SIZ） | 18% | 3 |
| 磺胺甲噁唑（SMZ） | 18% | 3 |
2.5 样本回收率：
组织 蜂蜜 水样………………95±25%
尿液 牛奶 血清………………85±25%
蛋类………………………………90±25%
3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准品：各1ml
0ppb 0.5ppb 1.5ppb 4.5ppb 13.5ppb 40.5ppb
高标准品（红盖）：1ppm ……………1ml
酶标记物（红盖）……………………5.5ml
抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
2×浓缩复溶液（黄盖） ……………50ml
说明书…………………………………1份
盖板膜…………………………………1张
自封袋…………………………………1个
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪 打印机 均质器 氮气吹干装置 振荡器 离心机 恒温培养箱 天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl 100µl-1000µl,多道300µl
4.3 试剂：乙酸乙酯 正己烷 乙腈 十二水合磷酸氢二钠 氢氧化钠 浓盐酸（质量分数36%） 二水合磷酸二氢钠
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头,以避免污染干扰实验结果.
5.2 配液：
配液1：0.2M氢氧化钠溶液
称取0.8g氢氧化钠加去离子水混匀溶解,定容至100ml.
配液2：0.02M PB缓冲液
称取2.58g十二水合磷酸氢二钠和0.44g二水合磷酸二氢钠加去离子水混匀溶解,定容至500ml.
配液3：0.5M盐酸溶液
取4.3ml浓盐酸加入去离子水混匀,定容至100ml.
配液4：复溶液（注：若检测样本为水样则勿配此液）
将2×浓缩复溶液用去离子水2倍稀释（1份2×浓缩复溶液加1份去离子水）,用于样本的复溶,复溶液在4℃环境可保存一个月.
配液5：工作洗涤液
将20×浓缩洗涤液20倍稀释（1份20×浓缩洗涤液加19份去离子水）.
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1组织样本（高检测限）处理方法
1）称取3g±0.05g均质组织样本置离心管中,加入3ml 0.02M PB缓冲液（配液2）充分振荡混匀,再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈,充分振荡10min,室温4000r/min离心10min；
2）移取2ml上层液体（约相当于1g的样本）在50℃-60℃氮气或空气吹干；
3）加入1ml正己烷溶解干燥的残留物,再加入1ml复溶液（配液4）,振荡1min,室温4000r/min离心5min；
4）除去上层正己烷,取下层水相50µl用于分析.
样本稀释倍数：1 检测下限：0.5ppb
5.3.2 组织样本（低检测限）处理方法
1）称取2g±0.05g 均质组织样本于离心管中,加入8ml 0.02M PB缓冲液（配液2）,振荡2min,室温4000r/min离心10min；
2）取50µl上层液体用于分析.
样本稀释倍数：5 检测下限：2.5ppb
5.3.3血清样本处理方法
1）将血液样本于室温放置30min,室温4000r/min离心10min,分离出血清；
2）取1ml血清,加入3ml 0.02M PB缓冲液（配液2）,振荡30s；
3）取50µl用于分析.
样本稀释倍数：4 检测下限：2ppb
5.3.4 蜂蜜样本处理方法
1）称取1g±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中,加入1ml 0.5M盐酸溶液（配液3）置于37℃环境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M 氢氧化钠溶液（配液1）,再加入4ml乙酸乙脂振荡5min,室温4000r/min离心10min；
3）取2ml上层液体于50℃-60℃下氮气或空气吹干,加入0.5ml复溶液（配液4）复溶,振荡30秒；
4）取50µl用于分析.
样本稀释倍数：1 检测下限：0.5ppb
5.3.5 尿液处理方法
1）用3ml 0.02 M PB缓冲液（配液2）与1ml离心后的清亮尿液混合,振荡30秒；
2）取50µl液体用于分析.
样本稀释倍数：4 检测下限：2ppb
5.3.6牛奶样本处理方法
1）将牛奶样本用0.02 M PB缓冲液（配液2）20倍稀释（如20µl牛奶加380µl 0.02M PB缓冲液）,振荡30秒；
2）取50µl用于分析.
样本稀释倍数：20 检测下限：10ppb
5.3.7水样处理方法
1）取澄清水样（浑浊水样需室温4000r/min离心10min以得到澄清水样）200ul加入200ul 2×浓缩复溶液,混合30秒；
2）取50µl用于分析.
样本稀释倍数：2 检测下限：1ppb
5.3.8 蛋类样本处理方法
1）用均质器均质蛋类样本；
2）称取2g±0.05g均质后的蛋类样本至50ml离心管中,加入8ml乙腈,立即用振荡器振荡10min,室温4000r/min离心5min；
3）移取2ml上清液至10ml洁净干燥玻璃试管中,于50℃-60℃氮气或空气吹干；
4）加入1ml正己烷溶解干燥的残留物,振荡30秒,再加入1ml复溶液（配液4）,振荡1min,室温4000r/min离心5min；
5）去除上层有机相,取下层水相50µl用于分析.
样本稀释倍数：2 检测下限：1ppb
6 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出,置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解,每种液体试剂使用前均须摇匀.取出需要数量的微孔板及框架,将不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃.
6.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置.
6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中,然后加酶标记物50µl/孔,再加入50µl/孔的抗体工作液,用盖板膜封板,轻轻振荡5秒混匀,25℃反应45min.
6.3 洗 涤：小心揭开盖板膜,甩去孔内液体,每孔加350µl 工作洗涤液,静置30秒后弃去,重复洗涤5次,最后一次拍干（用吸水纸拍干,拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）.
6.4 显 色：每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,轻轻振荡5秒混匀,25℃避光显色15min（若蓝色过浅,可适当延长反应时间）.
6.5 终 止：每孔加入终止液50µl,轻轻振荡混匀,终止反应.
6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）.测定应在终止反应后10min内完成.
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0ppb）的吸光度值的平均值（双孔）,再乘以100%,即
| 百分吸光率（%）＝ | A | ×100% |
| A0 |
A—标准品或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准品的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标,对应的标准品浓度（ppb）的对数为横坐标,绘制标准品的半对数曲线图.将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度.
若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样本的准确 快速分析.（欢迎来电索取）
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低.
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象.所以洗板拍干后应立即进行下一步操作.
8.3 混合要均匀,洗板要彻底,在ELISA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性.
8.4 在所有孵育过程中,用盖板膜封住微孔板,避免光线照射.
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒,不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂.
8.6 显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之.0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时,表示试剂可能变质.
8.7 反应终止液有腐蚀性,避免接触皮肤.
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存,避免冷冻.
保 质 期：该产品有效期为1年,生产日期见包装盒.
