测定意义

测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究
中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液
及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

• 规格: 分光光度法 48 样, 带标准品

• 检测原理: DPPH 法

• 编号: YS2133A

• 检测波长: 515nm

注意事项

• 预测定: 正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定

 

测定原理

DPPH·为稳定的自由基，在醇溶液中呈紫色，515nm 波长处有强吸收。当有抗氧化剂存
在时，溶液会发生脱色反应且吸光值变小，借此可评估清除自由基的能力。

自备仪器和用品

• 恒温水浴锅

• 低温离心机

• 可见分光光度计

• 1mL 玻璃/石英比色皿

• 80%甲醇(重做标曲使用)

• 蒸馏水

试剂清单

试剂名称	规格	数目	贮藏
提取液	液体	80mL x1	4℃
试剂一	液体	40mL x1	4℃, 避光
标准品	粉剂	x1	4℃, 避光
1mg Trolox	标准粉剂	仅供教研使用

样品提取

一、血清、血浆、唾液或尿液等液体样品

• 血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用 EDTA 抗凝）5000rpm 4℃离心 10min，取上清待测；

• 血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过 30 天）后再测定；

二、组织样品

1. 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆；

2. 然后 10,000g 离心力 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

三、细胞样品

1. 按照细胞数量（10^4个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；

2. 然后 10,000g 离心力 4℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。

实验准备

1. 分光光度剂预热 30min，调节波长至 515nm；

测定操作

1. 在 EP 管中依次操作

试剂名称（μL）	测定管	对照管（*选做）	空白管（*只做一管）
样本	400	400	-
提取液	-	600	400
试剂一	600	-	600

• 混匀，室温（25℃）避光反应 30min

• 于 515nm 波长，等体积提取液调零，测定各管吸光值 A

注意事项

1. 有色样本需设立对照管，无色样本可以不做对照管；

2. 建议选择几个差异较大的样本做预实验，如果反应结束后出现浑浊或沉淀，建议扩大反应体系操作（例如测定管：480μL 样本+720μL 试剂一，对照管和空白管体系与测定管同步放大），混匀，室温（25℃）避光反应 30min。反应结束后 8,000rpm 室温离心 5min，取 1mL 上清液于玻璃/石英比色皿测定 515nm 吸光值；

3. 若 A 测定或(A 测定-A 对照) <0.05，说明清除能力过高，需对样本使用提取液稀释，稀释倍数 D 代入公式计算；

4. 注意每管操作间隔不易过长，若一次性样本较多，建议分批检测；

5. 试剂一为 DPPH/甲醇溶液，易挥发，反应时建议密封；

6. 操作时应在通风条件良好的环境中进行，以免吸入过量甲醇中毒；

结果计算

一、以 DPPH 自由基清除率表示

• DPPH 自由基清除率（%）= (1-[(A 测定-A 对照)÷A 空白])×100%

• 或

• DPPH 自由基清除率（%）= (1-[A 测定÷A 空白])×100%

二、以标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量表示

1. 按样本质量计算

   • DPPH 自由基清除能力(μg Trolox/g 鲜重) = (清除率%÷100%+0.003)÷0.0287×V÷W×D

2. 按样本蛋白浓度计算

   • DPPH 自由基清除能力(μg Trolox/mg prot) = (清除率%÷100%+0.003)÷0.0287÷Cpr×D

3. 按细胞密度计算

   • DPPH 自由基清除能力(μg Trolox/10^4 cell) = (清除率%÷100%+0.003)÷0.0287×V÷细胞数量(万个)×D

4. 按液体体积计算

   • DPPH 自由基清除能力(μg Trolox/mL) = (清除率%÷100%+0.003)÷0.0287×D

• V：加入提取液体积，1mL；

• D：额外稀释倍数；

• Trolox 分子量，250.29；

• W：样品质量，g；

• Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

预实验的意义

比色法检测试剂盒预实验非常重要

1. 确定该试剂盒是否适合客户的样本检测，以免造成试剂盒和样本的浪费（比如低表达处理的样本）；

2. 熟悉生化试剂盒的操作流程，尤其是初次使用生化试剂盒测定；

3. 确定样本的处理方法及稀释倍数是否合适；

4. 了解实验过程中可能出现的实验现象或问题，以便于及时作出调整；

5. 通过 3 - 5 组预实验，判断试剂盒对于样本的最佳适应稀释浓度范围，指导实验样本稀释比例。

附：标准曲线的绘制（选做）

1. 标准品① 管中加入 2mL 80%甲醇 充分溶解即为 0.5mg/mL；

2. 将标准品(0.5mg/mL) 使用 80%甲醇稀释为 25、20、15、10、5、0 μg/mL；
   (也可根据自身实验需求调整标准品浓度)

3. 依据以下测定步骤操作，根据结果绘制标准曲线

试剂名称（μL）	标准管	空白管（*只做一管）
标准品	400	-
80%甲醇	-	400
试剂一	600	600

• 混匀，室温（25℃）避光反应 30min

• 于 515nm 波长，等体积 80%甲醇调零，测定各管吸光值 A

• 清除率（%）= (1-[A 标准÷A 空白])×100%）

① 开盖前甩下或离心 使粉剂落入底部后 小心开盖