一、构建方法
-
载体设计与构建
-
PVRIG过表达载体：选择慢病毒或逆转录病毒载体（如pCDH、pLenti等），将PVRIG基因的全长CDS序列克隆至多克隆位点，并引入强启动子（如CMV或EF1α）。
-
NFAT-Luc2报告系统：在Jurkat细胞中整合NFAT响应元件驱动的荧光素酶报告基因（如pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]），用于实时监测T细胞活化信号（如钙离子通路）。
-
筛选标记：加入抗生素抗性基因（如嘌呤霉素、新霉素）或荧光标记（如GFP）用于稳转株筛选。
-
-
病毒包装与感染
-
将重组载体与包装质粒（如psPAX2、pMD2.G）共转染HEK293T细胞，收集含有慢病毒颗粒的上清。
-
通过离心感染或Polybrene增强感染效率，将病毒颗粒感染Jurkat-NFAT-Luc2细胞系。
-
-
稳转株筛选与验证
-
抗生素筛选：使用嘌呤霉素（或相应抗生素）连续处理2-3周，筛选出稳定整合PVRIG的细胞株。
-
表达验证：
-
qPCR/Western Blot：检测PVRIG mRNA及蛋白表达水平。
-
流式细胞术：若载体含荧光标签（如GFP），可直接检测阳性细胞比例。
-
-
功能验证：通过抗CD3/CD28抗体刺激或钙离子载体（如离子霉素）激活NFAT通路，检测荧光素酶活性（Luciferase Assay）以确认报告系统的响应性。
-
二、科学意义
-
研究PVRIG的免疫功能
-
PVRIG是新兴的免疫检查点分子，与TIGIT/CD96/CD226家族共同调控T细胞和NK细胞功能。通过过表达模型可解析PVRIG对T细胞活化、增殖、细胞因子分泌（如IL-2、IFN-γ）的抑制或协同作用。
-
结合NFAT报告系统，可定量分析PVRIG对TCR信号通路（如PLCγ-Ca²⁺-NFAT轴）的影响。
-
-
肿瘤免疫治疗靶点探索
-
PVRIG在多种肿瘤（如结直肠癌、卵巢癌）中高表达，可能通过介导免疫逃逸促进肿瘤进展。稳转株可用于高通量筛选靶向PVRIG的抗体或小分子抑制剂，评估其对T细胞抗肿瘤活性的恢复效果。
-
与PD-1/CTLA-4抑制剂联用时，可研究PVRIG阻断剂的协同效应。
-
-
构建体外免疫微环境模型
-
将稳转株与肿瘤细胞共培养，模拟肿瘤-T细胞相互作用，通过检测荧光素酶信号动态评估PVRIG对T细胞浸润和杀伤功能的影响。
-
结合CRISPR/Cas9敲除技术，可反向验证PVRIG的上下游调控网络。
-
三、技术难点与优化
-
转染效率提升：Jurkat细胞转染难度较高，需优化电穿孔参数（如电压、脉冲时间）或改用慢病毒系统。
-
报告系统稳定性：长期传代可能导致NFAT-Luc2信号衰减，需定期检测荧光素酶活性并分选高表达亚群。
-
脱靶效应控制：需设置空载体对照（Vector Control）及未转染野生型细胞，排除载体或抗生素对细胞功能的干扰。
四、应用前景
该稳转株可广泛应用于：
-
药物开发：筛选靶向PVRIG的免疫治疗药物。
-
机制研究：解析PVRIG与DNAM-1/TIGIT等配体的相互作用机制。
-
临床前模型：构建人源化小鼠模型，评估PVRIG抑制剂在体内的抗肿瘤效果。
通过这一模型的构建，研究者能够深入探索PVRIG在免疫调控中的分子机制，并为开发基于PVRIG靶点的肿瘤免疫疗法提供重要实验工具和理论依据。
