一、稳转株构建方案
1. 载体设计
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多顺反子载体策略：
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使用 2A肽（如P2A/T2A） 连接多个基因，构建单载体共表达系统。
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基因顺序建议：NFAT响应元件-Luc2 + PD1-T2A-TIGIT-P2A-PVRIG（需优化阅读框）。
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选择标记：嘌呤霉素（Puromycin） 或 Blasticidin 抗性基因。
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病毒载体选择：
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采用 慢病毒载体（如pLVX-EF1α）提高Jurkat细胞的转导效率。
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分载体策略（若单载体难度大）：
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载体1：NFAT-Luc2 + 嘌呤霉素抗性。
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载体2：PD1-TIGIT-PVRIG（2A连接） + Blasticidin抗性。
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2. 病毒包装与转导
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慢病毒生产：
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使用HEK293T细胞共转染包装质粒（psPAX2、pMD2.G）与目标载体。
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超速离心浓缩病毒液，测定滴度（TU/mL）。
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Jurkat细胞感染：
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优化MOI（通常1-5），加入Polybrene（8 μg/mL）增强感染效率。
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分步感染：先转导NFAT-Luc2，筛选后转导PD1-TIGIT-PVRIG。
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3. 稳转株筛选
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抗性筛选：
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嘌呤霉素（1-2 μg/mL）和Blasticidin（5-10 μg/mL）梯度筛选，持续7-10天。
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逐步加压避免细胞毒性。
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单克隆化：
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有限稀释法获得单克隆，确保基因稳定整合。
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4. 验证实验
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表达验证：
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流式细胞术：检测PD1、TIGIT、PVRIG膜表面表达。
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荧光素酶活性：NFAT激活后（如离子霉素/PMA刺激）检测Luc2发光值。
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Western Blot：验证2A肽切割效率及蛋白表达。
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功能验证：
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抑制性信号检测：与表达CD155（TIGIT/PVRIG配体）、PD-L1的靶细胞共培养，观察T细胞活化（CD69/CD25）及IL-2分泌抑制。
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报告基因响应：通过TCR刺激（如抗CD3/CD28抗体）激活NFAT通路，量化Luc2信号动态变化。
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二、应用方向
1. 免疫检查点抑制剂筛选
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体外模型：
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将稳转株与肿瘤细胞（如Raji细胞）共培养，加入抗PD1、抗TIGIT等抗体，通过Luc2信号变化评估抑制剂对NFAT通路（T细胞活化）的挽救效果。
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高通量筛选：
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利用Luc2的发光特性，自动化检测候选化合物对T细胞功能的恢复能力。
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2. 协同抑制机制研究
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信号通路交叉：
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敲低PVRIG或TIGIT，观察PD1抑制信号的依赖性。
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分析共表达条件下下游分子（如SHP-2、PI3K-AKT）的磷酸化水平。
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3. 肿瘤微环境模拟
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3D共培养系统：
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将稳转株与表达多种配体的肿瘤类器官共培养，模拟体内抑制环境。
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联合免疫细胞（如Treg）研究多重抑制信号的叠加效应。
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4. 体内治疗评估
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小鼠模型：
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将稳转株注射至NSG小鼠（或人源化PDX模型），通过活体成像（Luc2）监测T细胞在肿瘤中的迁移与活化。
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评估检查点抑制剂对T细胞持久性的影响。
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三、关键注意事项
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基因干扰风险：PD1/TIGIT过表达可能导致细胞凋亡，需控制表达水平（弱启动子或诱导型系统）。
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信号串扰：PVRIG与TIGIT竞争结合CD155，需设计配体表达差异化的实验组。
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克隆异质性：单克隆筛选后需扩大培养并多次验证功能一致性。
四、预期成果
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获得高表达PD1-TIGIT-PVRIG且NFAT-Luc2响应灵敏的Jurkat稳转株。
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建立适用于免疫治疗药物筛选及机制研究的体外/体内平台。
如需进一步实验细节优化或具体protocol，可提供补充信息！
