一、实验原理
Jurkat细胞（人T淋巴细胞系）广泛用于T细胞受体（TCR）信号通路和免疫调控研究。通过构建稳定过表达 TREM2/DAP12 基因并携带 NFAT-Luc2 报告系统的Jurkat细胞株，可实现以下目标：
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TREM2/DAP12信号通路研究：模拟髓系细胞中TREM2-DAP12复合物的功能，研究其对T细胞活化、炎症因子分泌的影响。
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NFAT转录活性实时监测：通过荧光素酶（Luc2）活性动态检测NFAT信号通路的激活状态，适用于高通量药物筛选或基因功能验证。
二、材料与试剂
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细胞与载体
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Jurkat细胞（ATCC TIB-152）
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慢病毒载体（如pLenti-CMV-TREM2-IRES-DAP12，含嘌呤霉素抗性）
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NFAT-Luc2报告质粒（如pGL4.30-NFAT-RE-Luc2）
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辅助质粒：psPAX2（包装质粒）、pMD2.G（VSVG包膜质粒）
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试剂
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病毒包装试剂：Lipofectamine 3000、PolyJet
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细胞培养基：RPMI-1640 + 10% FBS
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抗生素：嘌呤霉素（Puromycin）、G418
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荧光素酶检测试剂盒（如Promega Bright-Glo™）
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流式抗体：抗-TREM2（克隆号：eBioR2-TREM2）、抗-DAP12
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仪器
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荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪（化学发光检测模块）
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三、构建流程
1. 载体设计与克隆
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目标基因克隆：
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TREM2（NCBI Gene ID: 54209）：全基因合成并克隆至慢病毒载体CMV启动子下游。
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DAP12（NCBI Gene ID: 9140）：通过IRES序列与TREM2共表达（TREM2-IRES-DAP12），确保同步翻译。
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NFAT-Luc2：将NFAT反应元件（RE）插入荧光素酶报告载体pGL4.30，构建pGL4.30-NFAT-RE-Luc2。
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载体验证：
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双酶切（如EcoRI/XbaI）确认插入片段大小。
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Sanger测序验证TREM2/DAP12开放阅读框（ORF）。
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2. 慢病毒包装与Jurkat感染
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病毒生产（HEK293T细胞）：
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共转染三质粒系统（目标载体+psPAX2+pMD2.G），Lipofectamine 3000转染48小时。
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收集病毒上清，0.45 μm滤膜过滤，-80℃分装保存。
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Jurkat细胞感染：
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预实验优化MOI（建议MOI=5-10）。
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加入Polybrene（终浓度8 μg/mL），离心感染（1000×g，32℃，2小时）。
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感染后48小时，加入嘌呤霉素（1 μg/mL）筛选7天。
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3. 稳转株筛选与单克隆化
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双抗筛选：
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同时筛选TREM2/DAP12（嘌呤霉素）和NFAT-Luc2（G418，0.5 mg/mL）。
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单克隆分离：
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有限稀释法（0.5细胞/孔）铺96孔板，2周后显微镜观察单克隆生长。
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4. 稳转株功能验证
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基因表达验证：
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qRT-PCR：检测TREM2/DAP12 mRNA表达（引物设计跨外显子-内含子边界）。
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Western Blot：检测TREM2（~25 kDa）、DAP12（~12 kDa）蛋白表达。
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NFAT-Luc2报告系统验证：
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刺激Jurkat细胞（如PMA/Ionomycin或抗CD3/CD28抗体），检测荧光素酶活性（化学发光值）。
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四、应用方向
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TREM2/DAP12信号机制研究
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探究TREM2-DAP12复合物对T细胞活化（CD69/CD25表达）、细胞因子（IL-2、IFN-γ）分泌的影响。
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药物筛选平台
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筛选靶向TREM2/DAP12的小分子抑制剂或激动剂（通过NFAT-Luc2活性变化评估）。
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免疫突触研究
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与抗原呈递细胞（APC）共培养，分析TREM2在免疫突触形成中的作用。
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五、注意事项
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共表达必要性：DAP12是TREM2信号传导的关键适配蛋白，需确保两者共表达。
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抗生素浓度优化：Jurkat对嘌呤霉素敏感，需预实验确定最低有效浓度。
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功能验证完整性：需同时验证基因表达（mRNA/蛋白）和报告系统活性。
六、参考文献
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Bouchon A, et al. TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature. 2001.
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Lanier LL, et al. DAP12 and KARAP in the immune system. Immunol Rev. 2006.
