背景
HCT116细胞是一种人类结肠癌细胞系，广泛用于癌症研究，尤其是结肠癌的分子机制和药物筛选。hCCAT2（人类结肠癌相关转录本2）是一种长链非编码RNA（lncRNA），在结肠癌中高表达，与肿瘤增殖、转移和化疗耐药性密切相关。通过构建hCCAT2基因敲除株，可以深入研究其在结肠癌中的功能，并为结肠癌治疗提供潜在靶点。
构建步骤
材料与试剂
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HCT116细胞
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CRISPR-Cas9质粒（含hCCAT2特异性sgRNA）
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转染试剂（如Lipofectamine 3000）
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嘌呤霉素（Puromycin）或其他筛选抗生素
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T7E1核酸酶或测序引物
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PCR试剂
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细胞培养基（如McCoy's 5A）
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FBS（胎牛血清）
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PBS（磷酸盐缓冲液）
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细胞冻存液
1. sgRNA设计与载体构建
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使用CRISPR设计工具（如CRISPR Design或CHOPCHOP）设计靶向hCCAT2基因的sgRNA，确保靶向hCCAT2的关键功能区域。
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将sgRNA序列克隆到CRISPR-Cas9质粒中，构建hCCAT2敲除载体。
2. 细胞培养与转染
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在37°C、5% CO2条件下培养HCT116细胞，使用含10% FBS的McCoy's 5A培养基。
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当细胞密度达到80%时，用CRISPR-Cas9质粒和转染试剂（如Lipofectamine 3000）进行转染。
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转染后48小时，加入嘌呤霉素（1-2 μg/mL）筛选转染成功的细胞。
3. 单克隆细胞筛选
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将筛选后的细胞稀释至单个细胞/孔，接种于96孔板。
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培养2-3周，直至形成单克隆细胞群。
4. 基因敲除验证
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提取单克隆细胞的基因组DNA，设计引物扩增hCCAT2基因靶向区域。
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使用T7E1核酸酶检测突变，或通过Sanger测序确认敲除效果。
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通过qPCR检测hCCAT2表达水平，进一步验证敲除效果。
5. 功能验证
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检测hCCAT2敲除对HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。
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研究hCCAT2在结肠癌细胞化疗耐药性中的作用。
应用与意义
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研究hCCAT2的生物学功能：
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hCCAT2作为lncRNA，在结肠癌中高表达，敲除株的构建有助于揭示其在肿瘤发生、发展和转移中的分子机制。
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结肠癌机制研究：
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HCT116细胞是结肠癌研究的经典模型，hCCAT2敲除株可用于研究其在结肠癌增殖、转移和化疗耐药性中的作用。
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药物靶点筛选：
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hCCAT2可能作为潜在的结肠癌治疗靶点，敲除株可用于筛选靶向hCCAT2或其相关通路的小分子药物。
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临床意义：
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hCCAT2在结肠癌患者中高表达，敲除株的研究结果可为结肠癌的早期诊断和治疗提供理论依据。
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注意事项
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sgRNA设计：确保sgRNA靶向hCCAT2基因的关键功能区域，避免脱靶效应。
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单克隆筛选：确保单克隆细胞来自单个细胞，避免混合克隆。
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功能验证：结合多种实验方法（如增殖、凋亡、迁移实验）全面评估hCCAT2敲除的影响。
参考文献
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Ling, H., et al. (2013). CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research, 23(9), 1446-1461.
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Redis, R. S., et al. (2016). CCAT2, a novel long non-coding RNA in colorectal cancer, regulates cell proliferation and invasion. Oncotarget, 7(8), 8461-8473.
通过构建HCT116细胞hCCAT2基因敲除株，可以深入研究其在结肠癌中的功能，为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的理论依据和潜在靶点。
