背景

4T1细胞是一种小鼠乳腺癌细胞系，常用于肿瘤生物学研究。mTmem176b（小鼠跨膜蛋白176b）基因在免疫调节和肿瘤微环境中可能发挥重要作用。通过CRISPR-Cas9技术敲除mTmem176b基因，可以研究其在肿瘤发生、发展和免疫逃逸中的功能。

材料与试剂

• 4T1细胞

• CRISPR-Cas9质粒（含sgRNA）

• 转染试剂（如Lipofectamine 3000）

• 嘌呤霉素（Puromycin）

• T7E1核酸酶

• PCR引物

• 细胞培养基（如RPMI 1640）

• FBS（胎牛血清）

• PBS（磷酸盐缓冲液）

• 细胞冻存液

构建步骤

1. sgRNA设计：

   • 使用在线工具（如CRISPR Design）设计针对mTmem176b基因的sgRNA，确保靶向外显子区域。

   • 合成sgRNA并克隆到CRISPR-Cas9质粒中。

2. 细胞培养：

   • 在37°C、5% CO2条件下培养4T1细胞，使用含10% FBS的RPMI 1640培养基。

   • 细胞密度达到80%时进行转染。

3. 转染：

   • 将CRISPR-Cas9质粒与转染试剂混合，按照说明书进行转染。

   • 转染后48小时，加入嘌呤霉素（1-2 μg/mL）筛选转染成功的细胞。

4. 单克隆筛选：

   • 将筛选后的细胞稀释至单个细胞/孔，接种于96孔板。

   • 培养2-3周，直至形成单克隆细胞群。

5. 基因敲除验证：

   • 提取单克隆细胞的基因组DNA，设计引物扩增mTmem176b基因靶向区域。

   • 使用T7E1核酸酶检测突变，或进行测序确认敲除效果。

6. 功能验证：

   • 通过Western blot或qPCR检测mTmem176b蛋白或mRNA表达水平，确认敲除效果。

   • 进行功能实验（如增殖、迁移、侵袭实验）评估基因敲除对细胞行为的影响。

操作注意事项

• 无菌操作：所有步骤需在无菌条件下进行，避免污染。

• 细胞状态：确保细胞健康，避免过度生长或老化。

• 转染效率：优化转染条件，确保高效转染。

• 单克隆筛选：确保单克隆细胞来自单个细胞，避免混合克隆。

参考文献

• Ran, F. A., et al. (2013). Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 8(11), 2281-2308.

• Cong, L., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.

通过以上步骤，可以成功构建4T1细胞mTmem176b基因敲除株，并用于后续功能研究。