核受体共激活因子4（Ncoa4）是一种铁自噬受体蛋白，在铁代谢调控中发挥重要作用。本研究旨在利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建RAW264.7细胞mouse-Ncoa4基因敲除株，并初步探究Ncoa4缺失对细胞铁代谢的影响。通过设计特异性sgRNA，构建CRISPR-Cas9敲除载体，转染RAW264.7细胞，经药物筛选和单克隆筛选获得Ncoa4基因敲除细胞株。Western blot和qPCR验证Ncoa4蛋白和mRNA表达缺失。进一步检测发现，Ncoa4敲除导致细胞内铁离子浓度升高，铁蛋白表达上调，提示Ncoa4缺失可能影响细胞铁稳态。本研究成功构建了RAW264.7细胞mouse-Ncoa4基因敲除株，为深入研究Ncoa4在巨噬细胞铁代谢中的功能机制提供了重要工具。
关键词： Ncoa4；CRISPR-Cas9；基因敲除；RAW264.7细胞；铁代谢
1. 引言
铁是人体必需的微量元素，参与多种生理过程。铁代谢紊乱与多种疾病密切相关，包括贫血、神经退行性疾病和癌症等。Ncoa4是一种新发现的铁自噬受体蛋白，通过介导铁蛋白的自噬降解参与细胞内铁代谢调控。研究表明，Ncoa4在巨噬细胞铁循环中发挥重要作用，但其具体机制尚未完全阐明。
RAW264.7细胞是小鼠来源的巨噬细胞系，广泛应用于免疫学和炎症相关研究。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建RAW264.7细胞mouse-Ncoa4基因敲除株，并初步探究Ncoa4缺失对细胞铁代谢的影响，为深入研究Ncoa4在巨噬细胞铁代谢中的功能机制提供实验基础。
2. 材料与方法
2.1 材料
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RAW264.7细胞（ATCC）
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CRISPR-Cas9敲除载体（如pX459）
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感受态细胞（如Stbl3）
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质粒提取试剂盒
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细胞转染试剂（如Lipofectamine 3000）
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嘌呤霉素（Puromycin）
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细胞培养基（如DMEM）
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胎牛血清（FBS）
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青霉素-链霉素溶液
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TRIzol试剂
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逆转录试剂盒
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qPCR试剂盒
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Western blot相关试剂
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铁离子检测试剂盒
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抗体：Ncoa4抗体、铁蛋白抗体、β-actin抗体
2.2 方法
2.2.1 sgRNA设计与载体构建
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针对mouse-Ncoa4基因设计2-3条特异性sgRNA，并构建到CRISPR-Cas9敲除载体中。
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将构建好的载体转化感受态细胞，提取质粒并进行测序验证。
2.2.2 细胞转染与筛选
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将RAW264.7细胞接种于6孔板，待细胞密度达到70%-80%时进行转染。
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按照转染试剂说明书，将CRISPR-Cas9敲除载体转染进RAW264.7细胞。
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转染48小时后，加入嘌呤霉素进行药物筛选，持续筛选7-10天。
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将存活细胞进行有限稀释，接种于96孔板，培养2-3周，筛选单克隆细胞株。
2.2.3 Ncoa4基因敲除验证
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Western blot检测Ncoa4蛋白表达水平，验证基因敲除效率。
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qPCR检测Ncoa4 mRNA表达水平，进一步确认基因敲除效果。
2.2.4 细胞铁代谢检测
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使用铁离子检测试剂盒检测细胞内铁离子浓度。
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Western blot检测铁蛋白表达水平。
3. 结果
3.1 Ncoa4基因敲除细胞株的构建与验证
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成功构建了靶向mouse-Ncoa4基因的CRISPR-Cas9敲除载体。
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通过药物筛选和单克隆筛选，获得了Ncoa4基因敲除的RAW264.7细胞株。
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Western blot和qPCR结果显示，Ncoa4蛋白和mRNA表达水平显著降低，表明Ncoa4基因敲除细胞株构建成功。
3.2 Ncoa4缺失对细胞铁代谢的影响
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与野生型细胞相比，Ncoa4敲除细胞内铁离子浓度显著升高。
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Ncoa4敲除细胞中铁蛋白表达水平上调。
4. 讨论
本研究成功构建了RAW264.7细胞mouse-Ncoa4基因敲除株，并初步探究了Ncoa4缺失对细胞铁代谢的影响。结果表明，Ncoa4缺失导致细胞内铁离子浓度升高，铁蛋白表达上调，提示Ncoa4可能通过调控铁蛋白的自噬降解参与细胞内铁稳态的维持。
5. 结论
本研究成功构建了RAW264.7细胞mouse-Ncoa4基因敲除株，为深入研究Ncoa4在巨噬细胞铁代谢中的功能机制提供了重要工具。未来研究将进一步探讨Ncoa4在巨噬细胞铁代谢中的具体作用机制，以及其在相关疾病中的潜在作用。
参考文献
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Asano, T., Komatsu, M., Yamaguchi-Iwai, Y., Ishikawa, F., Mizushima, N., & Iwai, K. (2011). Distinct mechanisms of ferritin delivery to lysosomes in iron-depleted and iron-replete cells. Molecular and cellular biology, 31(10), 2040-2052.
致谢
感谢实验室各位老师和同学的帮助和支持。
