PANC02细胞ggaOVAL基因过表达稳转株实验步骤

点击次数:119次     发布时间:2025/3/6 9:57:57

 

PANC02细胞中ggaOVAL基因过表达稳转株实验方法

1. 实验材料

  • 细胞系: PANC02细胞

  • 质粒: 包含ggaOVAL基因的过表达载体(如pCDNA3.1)

  • 试剂: 脂质体转染试剂(如Lipofectamine 3000)、抗生素(如G418)、细胞培养基、PBS缓冲液、胰酶

  • 仪器: CO2培养箱、离心机、荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot设备

2. 实验步骤

2.1 细胞培养
  1. 复苏细胞: 从液氮中取出PANC02细胞,37°C水浴中快速解冻,转移至含10% FBS的DMEM培养基中。

  2. 培养细胞: 在37°C、5% CO2培养箱中培养,待细胞密度达到80%-90%时进行传代。

2.2 质粒转染
  1. 准备质粒: 提取并纯化包含ggaOVAL基因的质粒。

  2. 转染细胞:

    • 接种PANC02细胞至6孔板,密度为5×10^5 cells/well。

    • 使用Lipofectamine 3000按说明书将质粒转染至细胞。

    • 转染后6小时更换新鲜培养基。

2.3 抗生素筛选
  1. 筛选稳转株: 转染48小时后,加入含G418的培养基进行筛选,持续2-3周。

  2. 单克隆筛选: 使用有限稀释法将细胞接种至96孔板,筛选单克隆稳转株。

2.4 稳转株验证
  1. 荧光显微镜观察: 若质粒带荧光标记,可直接观察荧光表达。

  2. qPCR检测: 提取RNA,反转录为cDNA,通过qPCR检测ggaOVAL基因的表达水平。

  3. Western blot检测: 提取总蛋白,通过Western blot检测ggaOVAL蛋白的表达。

3. 数据分析

  • qPCR数据: 使用2^-ΔΔCt法分析ggaOVAL基因的相对表达量。

  • Western blot数据: 通过灰度分析比较ggaOVAL蛋白的表达水平。

4. 注意事项

  • 无菌操作: 全程保持无菌,避免污染。

  • 质粒质量: 确保质粒纯度和浓度适宜。

  • 筛选浓度: 预实验确定G418的最佳筛选浓度。

5. 实验记录

  • 详细记录细胞培养、转染、筛选和验证的每一步操作及结果。

总结

通过上述步骤,可获得ggaOVAL基因过表达的PANC02稳转株,并通过qPCR和Western blot验证其表达水平。

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