A549细胞hSMO基因过表达稳转株的构建与应用

1. 背景介绍

A549细胞是一种常用的人肺腺癌细胞系，广泛应用于癌症研究。hSMO（人类平滑化受体）基因在多种癌症中发挥重要作用，尤其是在Hedgehog信号通路中。构建hSMO基因过表达的A549稳转株，有助于研究其在肺癌中的作用机制。

2. 材料

• 细胞系：A549细胞

• 质粒：含有hSMO基因的过表达载体（如pCDNA3.1-hSMO）

• 转染试剂：Lipofectamine 3000或其他高效转染试剂

• 筛选抗生素：如G418

• 培养基：DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清（FBS）

• PBS缓冲液

• 胰酶

• 细胞冻存液：含10% DMSO的FBS

• PCR引物：用于验证hSMO基因表达的引物

• Western blot试剂：用于检测hSMO蛋白表达

3. 操作方法

3.1 质粒转染

1. 细胞培养：将A549细胞接种于6孔板中，培养至70-80%汇合度。

2. 质粒准备：将pCDNA3.1-hSMO质粒与Lipofectamine 3000按比例混合，室温孵育15分钟。

3. 转染：将质粒-转染试剂复合物加入细胞中，轻轻混匀，37°C、5% CO2培养箱中培养6小时。

4. 换液：6小时后更换为新鲜培养基，继续培养48小时。

3.2 抗生素筛选

1. 抗生素处理：在转染48小时后，加入含有G418的培养基（浓度根据预实验确定，通常为500-1000 μg/mL）。

2. 筛选：每2-3天更换一次含G418的培养基，持续筛选2-3周，直至未转染细胞全部死亡。

3. 单克隆筛选：将存活的细胞进行有限稀释，接种于96孔板中，培养至单克隆形成。

3.3 验证hSMO过表达

1. PCR验证：提取单克隆细胞的RNA，反转录为cDNA，使用hSMO特异性引物进行qPCR，验证hSMO基因的表达水平。

2. Western blot验证：提取细胞总蛋白，进行Western blot检测，验证hSMO蛋白的表达。

3.4 稳转株的冻存与复苏

1. 冻存：将验证后的稳转株细胞用细胞冻存液重悬，分装至冻存管中，程序降温后置于液氮中长期保存。

2. 复苏：将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入37°C水浴中解冻，接种于含10% FBS的DMEM培养基中，培养至细胞贴壁。

4. 发货方式

• 细胞发货：将冻存的稳转株细胞置于干冰中，使用泡沫箱包装，确保运输过程中细胞始终处于低温状态。

• 质粒发货：将质粒DNA溶于TE缓冲液中，置于冰袋中，使用泡沫箱包装，确保运输过程中质粒的稳定性。

• 其他试剂：根据试剂的稳定性要求，选择适当的运输方式（如冰袋、干冰等）。

5. 应用

• 功能研究：通过hSMO过表达的A549细胞，研究hSMO在肺癌细胞增殖、迁移、侵袭等过程中的作用。

• 药物筛选：利用该稳转株筛选靶向hSMO的药物，评估其抗癌效果。

• 信号通路研究：研究hSMO在Hedgehog信号通路中的作用机制，探索其在肺癌中的潜在治疗靶点。

通过以上步骤，可以成功构建hSMO基因过表达的A549稳转株，并应用于相关研究。