耐甲氧西林金黄色葡萄球菌探针法荧光定量PCR试剂盒(新品速递,现货供应))

点击次数:133次     发布时间:2025/3/5 11:24:27

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌探针法荧光定量PCR试剂盒技术文章

一、 简介

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是一种对多种抗生素具有耐药性的病原菌,其感染可导致严重的健康问题。快速、准确地检测MRSA对于临床诊断和感染控制至关重要。本试剂盒采用探针法荧光定量PCR技术,特异性检测MRSA的mecA基因,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

二、 实验原理

本试剂盒采用TaqMan探针法荧光定量PCR技术。针对MRSA的mecA基因设计特异性引物和探针,探针两端分别标记荧光报告基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)。PCR扩增过程中,Taq酶具有5'→3'外切酶活性,可将探针水解,使荧光报告基团与淬灭基团分离,产生荧光信号。荧光信号的强度与PCR产物的量成正比,通过实时监测荧光信号,即可实现对MRSA的定量检测。

三、 操作步骤

1. 样本处理

  • 临床样本: 取适量临床样本(如脓液、血液、痰液等),按照相关操作规程进行核酸提取。

  • 阳性对照: 试剂盒内提供的MRSA阳性对照。

  • 阴性对照: 试剂盒内提供的阴性对照或无菌水。

2. PCR反应体系配制

在无菌PCR管中按以下顺序加入各组分:

组分 体积 (μL)
2× PCR预混液 10
上游引物 (10 μM) 0.5
下游引物 (10 μM) 0.5
探针 (10 μM) 0.5
模板DNA 5
无菌水 补足至20

3. PCR反应程序

将PCR管置于荧光定量PCR仪中,设置以下反应程序:

步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 5 min 1
变性 95℃ 15 sec 40
退火/延伸 60℃ 1 min  

4. 结果分析

  • 阈值设定: 以阴性对照的荧光信号为基准,手动或自动设定阈值。

  • Ct值: 每个样本的Ct值代表荧光信号达到阈值时所经历的循环数。

  • 结果判断:

    • 阳性: Ct值 ≤ 35,且扩增曲线呈S型。

    • 阴性: Ct值 > 35,或无扩增曲线。

四、 实验方法

  • 引物和探针设计: 针对MRSA的mecA基因设计特异性引物和探针,并进行特异性验证。

  • 反应体系优化: 优化引物浓度、探针浓度、退火温度等参数,以获得最佳的扩增效率和特异性。

  • 灵敏度检测: 使用不同浓度的MRSA DNA进行检测,确定试剂盒的检测限。

  • 特异性检测: 使用其他常见病原菌的DNA进行检测,验证试剂盒的特异性。

五、 注意事项

  • 实验操作应在生物安全柜中进行,避免污染。

  • 所有试剂和耗材应保证无菌,避免DNA酶污染。

  • 加样时应避免产生气泡,以免影响荧光信号的检测。

  • 反应体系配制应在冰上进行,避免DNA降解。

  • PCR反应程序应根据实际情况进行调整。

  • 结果分析应结合临床资料进行综合判断。

六、 总结

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR技术,能够快速、准确地检测MRSA,为临床诊断和感染控制提供有力支持。

七、 参考文献

  • [1] 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测技术研究进展. 中国抗生素杂志, 2020, 45(10): 1001-1008.

  • [2] 实时荧光定量PCR技术在病原微生物检测中的应用. 中国生物工程杂志, 2019, 39(05): 1-10.

八、 免责声明

本试剂盒仅用于科研用途,不用于临床诊断。使用者应具备相应的专业知识和技能,并严格按照说明书进行操作。因操作不当导致的任何后果,本公司概不负责。

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