一、 技术概述

本技术文章旨在描述利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在293T细胞中构建hSMPD1基因敲除株的实验流程和关键参数。hSMPD1基因编码酸性鞘磷脂酶，该酶在细胞代谢和信号传导中发挥重要作用。构建hSMPD1基因敲除株有助于研究该基因的功能及其在相关疾病中的作用。

二、 细胞背景

• 细胞名称: 293T细胞

• 细胞类型: 人胚胎肾细胞，经SV40大T抗原转染

• 细胞特性: 易于转染，高水平表达外源蛋白

• 应用领域: 病毒包装，蛋白表达，基因功能研究

三、 培养条件

• 培养基: DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%青霉素-链霉素

• 培养条件: 37°C，5% CO2，饱和湿度

• 传代比例: 1:3至1:6，每2-3天传代一次

四、 修饰类型

• 基因修饰类型: hSMPD1基因敲除

• 基因ID: ENSG00000166333

• 目标位点: 根据实验设计选择hSMPD1基因的特定外显子区域进行敲除

五、 转导方法

• CRISPR-Cas9系统: 使用质粒或病毒载体将Cas9蛋白和靶向hSMPD1基因的sgRNA导入293T细胞

• 转染试剂: 根据实验需求选择合适的转染试剂，例如Lipofectamine 3000

• 转染步骤: 按照转染试剂说明书进行操作，优化转染条件以获得较高的敲除效率

六、 克隆类型

 

• 单克隆筛选: 通过有限稀释法或流式细胞分选技术获得单克隆细胞株

• 基因型鉴定: 使用PCR、测序等方法鉴定hSMPD1基因敲除情况

• 蛋白表达检测: 使用Western blot等方法检测hSMPD1蛋白表达水平，验证敲除效果

八、收货当天如何处理细胞？

收到细胞后请务必仔细阅读产品资料，了解细胞相关信息，如贴壁特性 (贴壁/悬浮/半贴壁半悬浮)、细胞形态、培养体系、传代比例和换液频率等。

| T25培养瓶常温运送

1. 收到细胞后，请先检查培养瓶是否完好，培养基是否外渗、浑浊，并核对瓶身上的标签信息、细胞数量是否与发货清单一致。如有异常情况，及时与我们联系。

    注：培养瓶内飘浮的小体积絮状物可能是脱落的细胞，对于这种情况，建议在细胞培养箱静置2 h 后再观察，如仍有细胞未贴壁，可收集培养上清离心后再接种到原瓶或新的培养容器中。

2. 用75%酒精消毒细胞培养瓶表面，不要打开培养瓶，将细胞平放于细胞培养箱内静置1~2 h，待细胞恢复基本生长状态后，再进行后续操作。

3. 显微镜下观察细胞状态，观察细胞时请拍摄清晰的100×、200×照片各2~3张留存。

4. 细胞种类不同，细胞的运输液不同。请根据培养瓶上的标识判断培养瓶内培养基是否可以继续使用。

5. 若细胞密度低于80%，请及时更换为预热的完全培养基培养。若细胞密度大于80%，可进行传代。具体见《细胞培养操作说明》。

| 冻存管干冰运送

1. 收到细胞后，请先检查包装是否完整，干冰是否充足，冻存管有无破损等情况，并核对冻存管上的标签信息、细胞管数是否与发货清单一致。如有异常情况，及时与我们联系。

2. 低温保存的细胞非常脆弱，细胞收到后如在24 h内复苏，可存放于-80℃冰箱；超过24 h请存放于液氮中。建议尽快复苏，具体复苏操作见《细胞培养操作说明》。

3. 复苏细胞后，首次换液之前需在显微镜下观察细胞状态，观察细胞时请拍摄清晰的100×、200×照片各2~3张留存。

4. 部分细胞贴壁时间较长，请根据说明书进行操作。若复苏有异常，及时与我们联系。

5. 后续根据细胞汇合度继续培养或消化传代。

| 血清管常温运送

 

1. 在收到细胞后，请先检查试剂管是否完好，培养基是否外渗，并核对试剂管上的标签信息、细胞管数是否与发货清单一致。如有异常情况，及时与我们联系。

2. 收到细胞后请尽快进行处理，如不能及时处理，请将细胞放至常温环境，通常15~25℃为佳，并尽量在24 h内处理。血清管细胞悬液可能会呈现一定程度的浑浊，属于正常现象，可放心操作。

3. 用75%酒精消毒血清管表面，在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次，转移至15 mL离心管中。

4. 吸取1 mL预热的完全培养基清洗血清管内壁，同样转移至15 mL离心管，并吹打均匀。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清，加入适量预热的完全培养基重悬后接种至合适大小的培养容器中，放置于培养箱内进行培养。

6. 首次换液前需在显微镜下观察细胞状态，观察细胞时请拍摄清晰的100×、200×照片各2~3张留存。

7. 后续根据汇合度继续培养或消化传代。具体见《细胞培养操作说明》。

| 细胞胶囊技术

 

 

 

 

1. “细胞胶囊”包括细胞管和溶解Buffer共2个试剂管。收到细胞后，请先检查试剂管是否完好，培养基是否外渗，并核对管身上的标签信息、细胞数量是否与发货清单一致。如有异常情况，及时与我们联系。

2. 收到“细胞胶囊”后需尽快处理, 如不能及时处理, 请将细胞放至常温环境, 通常15~25℃为佳，并尽量在24 h内处理。“细胞胶囊”管内的液体肉眼观察可能会呈现一定程度的浑浊，这属于正常现象，可放心操作。

3. 用75%酒精消毒试剂管表面，在洁净工作台内小心的打开细胞胶囊管盖，尽量避免气泡溢出。 

4. 小心弃去细胞胶囊管中的全部液体。

5. 将溶解Buffer全部加入到细胞胶囊管中，拧紧管盖，上下颠倒3~5 min。观察到球状的细胞胶囊完全溶解后，小心开盖，使用移液枪轻柔吹打数次，将所有液体转移到15 mL离心管内。

7. 250 g离心4 min。离心后去上清，加入适量预热完全培养基重悬后，将细胞悬液接种到合适大小的培养容器中（T25瓶或6cm皿），放置于细胞培养箱中培养。

8. 首次换液前需在显微镜下观察细胞状态，观察细胞时请拍摄清晰的100×、200×照片各2~3张留存。如有异常情况，及时与我们联系。

9. 后续根据细胞汇合度继续培养或消化传代。具体见《细胞培养操作说明》。