1. 引言
HCT 116细胞是一种常用的人类结肠癌细胞系，广泛应用于癌症研究、药物筛选和基因功能研究。hS1PR3（Sphingosine-1-phosphate receptor 3）是一种G蛋白偶联受体，参与调控细胞增殖、迁移和存活等过程。通过CRISPR/Cas9技术敲除HCT 116细胞中的hS1PR3基因，可以深入研究该基因在结肠癌中的功能及其潜在的治疗靶点。
2. 细胞背景
HCT 116细胞源自人类结肠癌组织，具有上皮细胞形态，常用于研究结肠癌的分子机制和药物反应。该细胞系具有较高的增殖能力和遗传稳定性，适合进行基因编辑操作。hS1PR3基因在多种癌症中表达异常，可能与肿瘤的发生、发展及转移相关。
3. 实验材料
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细胞系：HCT 116细胞（ATCC® CCL-247™）
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CRISPR/Cas9系统：包括Cas9表达载体、sgRNA设计工具、hS1PR3特异性sgRNA
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转染试剂：Lipofectamine 3000或类似产品
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筛选标记：Puromycin或GFP
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培养基：DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清（FBS）
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PCR和测序引物：用于验证基因敲除
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相关抗体：用于Western blot验证hS1PR3蛋白表达
4. 操作步骤
4.1 sgRNA设计与载体构建
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sgRNA设计：使用在线工具（如CRISPR Design Tool）设计针对hS1PR3基因的sgRNA，选择靶向外显子区域的序列。
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载体构建：将设计的sgRNA克隆到Cas9表达载体中，确保载体包含筛选标记（如Puromycin抗性基因）。
4.2 细胞转染
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细胞培养：在37°C、5% CO2条件下培养HCT 116细胞，使用DMEM高糖培养基（含10% FBS）。
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转染：使用Lipofectamine 3000将构建好的CRISPR/Cas9载体转染到HCT 116细胞中，按照试剂说明书操作。
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筛选：转染48小时后，加入Puromycin（1-2 µg/mL）进行筛选，持续3-5天，直至未转染细胞全部死亡。
4.3 单克隆筛选
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单细胞分离：将筛选后的细胞稀释至每孔1个细胞，接种到96孔板中，培养至形成单克隆。
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扩增培养：挑选生长良好的单克隆，扩增培养以备后续分析。
4.4 基因敲除验证
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基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取单克隆细胞的DNA。
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PCR扩增：设计引物扩增hS1PR3基因靶向区域，进行PCR反应。
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测序分析：将PCR产物送测序，确认基因敲除情况。
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Western blot验证：使用hS1PR3特异性抗体进行Western blot，验证蛋白表达是否缺失。
5. 结果与讨论
通过上述步骤，成功构建了HCT 116细胞hS1PR3基因敲除株。PCR和测序结果显示，靶向区域的基因序列发生了预期的缺失或插入突变，Western blot结果证实hS1PR3蛋白表达完全缺失。该基因敲除株可用于进一步研究hS1PR3在结肠癌中的功能及其作为治疗靶点的潜力。
6. 参考文献
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Cong, L., et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science, 339(6121), 819-823.
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Ran, F. A., et al. (2013). Genome Engineering Using the CRISPR-Cas9 System. Nature Protocols, 8(11), 2281-2308.
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HCT 116细胞系说明书，ATCC® CCL-247™.
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Spiegel, S., & Milstien, S. (2003). Sphingosine-1-phosphate: an enigmatic signalling lipid. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 4(5), 397-407.
7. 相关产品
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HCT 116细胞：ATCC® CCL-247™
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CRISPR/Cas9系统：Addgene #48138（pSpCas9(BB)-2A-GFP）
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Lipofectamine 3000：Thermo Fisher Scientific, L3000015
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Puromycin：Sigma-Aldrich, P8833
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hS1PR3抗体：Abcam, ab174290
通过以上步骤和材料，研究人员可以成功构建HCT 116细胞hS1PR3基因敲除株，并应用于相关研究。
