血清制备

 

1.取血后，37oC 下，让血液凝固 1 到 2 小时（不加抗凝剂）；

 

2.4oC 冰箱过夜（让血块固缩）；

 

3.当血清自然析出后， 4oC，3000 转/分，离心 10 分钟，分离血清，弃去不溶物；

 

4.将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。

 

ELISA

 

一、包被抗原

 

1.用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解 抗 原 ，使抗原浓度为 10-20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶标板，4 oC 放置过夜。

 

2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC封闭 1 小时。

 

3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC 孵育 2 小时。

 

4. PBST 洗涤 5 次后，加入 100μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 oC 孵育 1 小时 。

 

5. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。

 

二、包被细胞

 

1.在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。

 

2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。

 

3. 加入 125 ?l/well 10% Formalin（1:10 稀释）, 室温下固定 15 min。

 

4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2-8oC 备用。

 

5. 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC 封闭 1 小时。

 

6. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC 孵育 2 小时。

 

7. PBST 洗涤 5 次后，加入 100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 oC 孵育 1 小时。

 

8. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：

0.2M

Na2HPO4

2.4ml

0.1M

柠檬酸 2.6ml

ddH2O

5ml

ABTS

5mg

H2O2(30%)

4ul（用前加入）

 

注意：

一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。

不同的显色系统对应不同的光吸收值。