1材料
E.coliJM109菌株
2仪器、用具
超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器
3试剂
(1)CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基
(2)RNaseA1；BufferS1；BufferS2；BufferS3；BufferW1；无水乙醇的BufferW2a
(3)1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液
(4)酚；
(5)ddH2O；10×PCRBuffer(Mg2plus)；dNTP；M13；M13-；TaKaRarTaq酶
4方法
1.大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4mlLB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4mlLB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。
(2)4℃，5000rpm离心2min，去上清液。
(3)加入750μl预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，冰浴30min。
(4)4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。
(5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。
2.重组DNA的转化
(1)将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。
(2)于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。
(3)将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。
(4)在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。
(5)将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。
注意事项：
①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。
②42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。
③菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
3．重组质粒的鉴定
方案一菌落PCR
(1)制备PCR混合液：
(2)用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
(3)盖上离心管得盖子，在沸水上温育10min。
(4)将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。
(5)按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。
(6)取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
方案二质粒PCR
1.碱裂解法少量制备质粒DNA
(1)用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。
(2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。
(3)加入250μlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。
*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。
(4)加入400μlBufferS3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。
(5)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。
(6)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。
(7)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer
W2洗涤一次。
(8)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm离心1min。
产品分类/PRODUCT CLASSIFICATION
