使用方法

pECMV-Slc6a4-m-FLAG收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒的抗性、感受态和培养温度。

1、质粒干粉（请务必转化挑单克隆重提后使用）

①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl 无菌水溶解质粒；

②取2μl质粒加至100μl 感受态中，冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；

（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

③加入500μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

④取10μl、100μl复苏液，并分别涂布至目标质粒抗性的LB平板上；

⑤将平板正向培养1h，再倒置37度培养14h。如果要求是30度则培养20h；

（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

2、甘油菌：四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。

3、穿刺菌：穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。

4、平板：直接挑取单菌落至液体培养基中。

5、液体质粒：单独提取的液体质粒收到后可直接使用。

pECMV-Slc6a4-m-FLAG是一个大肠杆菌表达载体，Tac强启动子可以驱动GST促溶标签和目的基因融合表达，LacI阻碍蛋白和Laco操作子使本质粒在没有加入IPTG之前禁止表达，防止其影响细菌生长。表达后的融合蛋白可用凝血酶蛋白酶切割，再过一次GST柱子即可清除掉GST标签。

 

 

操作流程
pECMV-Slc6a4-m-FLAG到货后请根据标签上文字判断产品属性（质粒/甘油菌）

1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

 2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

 3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

 4、42℃热激90s，再冰浴2min；

 5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

 6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

 7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

 8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

 9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。