TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒
产品信息：Kim于1994年借助PCR技术建立了灵敏的端粒酶检测方法——端粒重复片段扩增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。本产品是在其方法的基础上，进行适当改良，开发出来的研究用试剂盒。
本品与通常的端粒酶活性测定法相比较，具有以下特征：
1、内标与端粒酶提取液在同一管里进行PCR扩增，提高了检测的准确性。
2、提供了阳性对照，可以更加准确地判定阳性实验结果。
3、优化了引物设计，使PCR 效果进一步提高。
使用须知：本试剂盒为研究用试剂，不能将其作为诊断或临床检测试剂使用。
背景知识：端粒酶是合成染色体末端的端粒的酶。端粒（telomere）是真核细胞染色体的天然末端，由上千个6碱基重复序列(TTAGGG)组成，是细胞必需的遗传组分，它的作用是维持端粒有足够的长度，保证基因信息在复制过程中的准确性，以防止染色体末端遗传信息的丢失。在正常情况下，每个细胞分裂周期都会使端粒变的越来越短，当端粒短到一定程度时就会发出信号，细胞停止分裂。
端粒酶由RNA和蛋白质亚基组成，是基本的核蛋白逆转录酶，在细胞染色体复制过程中，能够以自身RNA为模板，在染色体3’末端合成重复序列，维持端粒的长度。端粒酶在正常体细胞中的活性被抑制，但是大量的资料表明在一些恶性肿瘤中的表达高达85%。
由于端粒酶特异地表达于各种肿瘤细胞，并且是大多数肿瘤细胞持续分裂所必需的。因此，端粒酶活性是诊断多数恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
基本原理：利用端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列的特性，采用PCR方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立的TRAP法，其主要原理如下：首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。
TBD-PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。
试剂盒组成：
| 组分 | 50 次实验量 |
| Wash buffer | 11ml |
| Lysis buffer | 2.2ml |
| 10×PCR buffer | 140μl |
| dNTPs | 165μl |
| Primer1 | 165μl |
| Primer2 | 28μl |
| Primer3 | 110μl |
| Taq -DNA Polymerase | 17μl |
| ddH2O | 750μl |
| 阳性对照模板 | 55μl |
| 内标准模板 | 55μl |
操作步骤
1、端粒酶的提取
⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。
⑵ 40～100mg 冷冻（-70％℃）组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入 40 ul Lysis buffer（使用前每 ml Lysis buffer 加入 2μl β-巯基乙醇）；或 1～2×106 沉淀细胞直接加入 40µl 预冷的 Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中 30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次。
备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入 Wash buffer。
⑶ 4℃离心（13000rpm,20min）。
⑷ 移取上清，分装 3-4 管，每管约 20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。
TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒
2、PCR 扩增(1×25ul)
3、PCR 扩增：
⑴ 每管加入Ⅰ液 9μl 及端粒酶提取液 1μl，混匀，30℃反应 30min。
⑵ 上述各管 93℃加热 1min 灭活。
⑶ 向上述各管中加入预热至 93℃的Ⅱ液各 13ul，混匀，进行第一步扩增。扩增条件如下：
第一步：
| 步骤 | 时间 | 温度 |
| 预变性 | 3m | 93℃ |
| 变性 | 35s | 93℃ |
| 退火 | 35s | 42℃ |
| 延伸 | 90s | 72℃ |
| 循环数 | 5 | |
| 延伸 | 60s | 72℃ |
（4）在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒，暂停仪器运行，快速向各管中加入primer3 2ul 和稀释后的内标准模板1ul。继续运行仪器，进行第二步扩增。扩增条件如下：
（5）
第二步（连接第一步）：
| 步骤 | 时间 | 温度 |
| 预变性 | 60s | 93℃ |
| 变性 | 40s | 93℃ |
| 退火 | 40s | 60℃ |
| 延伸 | 50s | 72℃ |
| 循环数 | 36 | |
| 延伸 | 8m | 72℃ |
4、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（所有溶液，用户自备）
⑴ 制备 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶（20ml）。
ddH2O11.19 ml
36%Acr-1%Bis5.46 ml
5%TEMED0.4 ml
10×电泳缓冲液2 ml
1.25% APS1 ml
⑵ 取10ul PCR产物与2ul上样缓冲液混合后加样，用0.5×电泳缓冲液作为电极缓冲液，180V电泳2h。
⑶ 小心剥离凝胶，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定过夜。
备注：
① 10×电泳缓冲液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不带 2Na) ，用ddH2O定容至 200ml。
② 10×上样缓冲液：0.01%溴酚兰、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH6.7)
5、银染（所有溶液，用户自备）
⑴ 将凝胶置于 10%醋酸固定30min后用蒸馏水漂洗3次，每次5min;
⑵ 将凝胶置于0.2g/L 硫代硫酸钠浸泡1min, 然后用蒸馏水漂洗3次，每次30s;
⑶ 将凝胶置于硝酸银染液中浸泡 30min, 然后用蒸馏水漂洗 30s;
⑷ 将凝胶置于显影液中显色 10min 左右直到全部条带显色清晰为止；
⑸ 将凝胶置于 5%醋酸中浸泡终止反应。
⑹ 选择适当时机照相。
备注：
① 硝酸银染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至 100ml。
② 显色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸钠，定容至 100ml。
6使用凝胶分析软件进行结果分析
实验方法的说明
1、端粒酶的提取：端粒酶本身有RNA 和酶功能基团，极其容易被降解、失活。因此，应该按提取细胞总RNA 的要求，尽量在低温条件下，快速操作。简化不必要的反复洗涤程序，提高提取液的蛋白质浓度。小量分装，尽量避免反复冻融。2、反应前，测定每个样品的蛋白质浓度，并稀释至同一浓度，以保证端粒酶样品加入量基本一致。
3、为了让实验更具有客观性，实验时，请务必设定阳性对照和阴性对照，本试剂盒提供阳性对照的模板，并提供阴性对照的实验方法。阳性对照的实验方法：另设一阳性对照管，以阳性对照模板代替端粒酶提取液加入即可。阴性对照的实验方法：可以把I液II液混合，每管24ul混合液，再加入端粒酶提取液，混匀后直接在90℃加热10min灭活，不经过PCR扩增，直接电泳，以排除样品中存在的蛋白质对核酸银染的干扰。
4、关于内标准模板的使用为了便于进行各样品间端粒酶活性的比较，我们提供了内标准物。该内标准物可以作为模板，用于检测端粒酶活性的同一对引物进行扩增。内标准模板扩增片段长度为：50bp。
该内标准物的使用有两种方法：
第一种方法：将内标准物以一定量加入到端粒酶样品之中，用同一对引物在同一扩增管内进行竞争性扩增。然后通过比较电泳图谱中内标准物和端粒酶扩增带的相对强度，即可达到相对定量的目的。考虑到实验方法的灵敏度，并避免PCR 扩增时的平台效应，只有当端粒酶的模板（与其活性相对应）和内标的模板比例相接近时，方能得到较理想的分析效果。
基于不同来源样品的端粒酶的活性不同，需要将高浓度的模板进行一系列的稀释，比如依次稀释为100、1000、10000、100000、1000000 等倍数，分别取1ul与等体积的端粒酶样品混合后作为模板，进行扩增。选择一个内标准物和端粒酶均能明显扩增的稀释度用于今后的实验。此种方法从理论上讲更严谨，考虑到了模板的长度，扩增效果和端粒酶活性的关系，但是需要客户自己摸索最佳条件。实验室建议在端粒酶活性比较高的情况下将内标准模板稀释105再进行扩增。
第二种方法：是将我们提供的高浓度内标准物，在进行电泳时加入。这样也能够实现半定量分析，而且方法简单可行。
常见问题
1、细胞提取物中没有足够的端粒酶：在冰浴条件下制备细胞和组织提取物，尽量缩短制备时间，适当用较高浓度的端粒酶样品，减少不必要的操作。
2、端粒酶的反应时间不够：保证反应时间不少于20min。
3、所有样品和阴性对照都成阳性：PCR残余污染。PCR反应的每一组分勿重复使用保证使用洁净的PCR管和PCR试管架
4、同一种组织会有不同的端粒酶的表达活性：动物本身就有种内差，每个个体的端粒酶的表达活性情况也会不一样。同一个体的不同组织（如睾丸/骨髓）端粒酶的表达也不一定相同。同一个体的同一组织的不同部位端粒酶的表达情况也不一定相同。
5、肿瘤组织中没有出现预期的端粒酶条带：肿瘤组织中端粒酶的表达达85%，也有部分肿瘤组织中没有端粒酶的表达，所以极少数肿瘤组织中有可能没有出现端粒酶的条带。
6、阳性对照中看不到梯度：因反复冻融会导致阳性对照中的端粒酶失活，所以应注意低温操作。
7、阴性对照里有梯度条带出现：PCR产物、lysis buffer及反应试剂等交叉污染，请将PCR扩增产物提取区域和反应试剂配制区域分开。另外请经常使用手套。电泳上样时的交叉污染，每次上样时更换枪头。
8、由于热处理、RNase处理不充分而引起梯度条带消失：将要使用的枪头用DEPC水浸泡至少24小时，再进行高压灭菌，烤干；提取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170℃烘烤5个小时。
9、端粒酶活性不高：改善端粒酶反应条件，适当增加端粒酶反应时间，适当增加PCR循环数（但要避免达到平台效应，使非特异性扩增大量出现），避免lysis buffer的恶化，尽量减少端粒酶样品反复冻融。实验操作的指导原则是快速，低温。
质量检测报告：
产品名称：TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒（TRAP-Silver Staining Telomerase Detection Kit）
HL-60细胞在37℃，5%CO2 培养箱培养，并利用本试剂盒进行检测，经电泳检测PCR产物，呈现阳性梯带，视为合格。
