**Agkistrodon蕲蛇染料法PCR鉴定试剂盒**
**Agkistrodon SYBR qPCR Kit**
**使用手册 V3.1**
---
一、产品简介
蕲蛇，属蝮蛇科蝮蛇属，是我国传统中药材之一，亦称“五步蛇”“白花蛇”。其全身黑质白花，吻鳞与鼻间鳞向上翘起，头部呈三角形，具较强毒性。蕲蛇主要分布于湖北蕲春、湖南、安徽等地，喜食蛙类、蜥蜴、鸟类及鼠类等。由于生长缓慢且栖息地受限，蕲蛇已被列为濒危动物。
蕲蛇具有祛风湿、舒筋活络、散风寒等药用功效，常用于中医药方中。为保障蕲蛇药材的真实性及质量控制，上海雅吉生物科技有限公司开发了本款 **蕲蛇染料法PCR鉴定试剂盒**，基于SYBR Green I 荧光染料法的实时荧光定量PCR技术，实现对蕲蛇DNA的高灵敏度、高特异性检测，适用于物种鉴定、药材真伪辨别及相关科研工作。
---
二、产品特点
1. **即开即用**：用户只需提供样品DNA模板，试剂盒内含所有qPCR反应所需组分。
2. **高灵敏度**：引物经优化设计，可检测低拷贝数的蕲蛇DNA。
3. **内置阳性对照**：提供已知拷贝数的阳性对照，便于识别假阴性结果。
4. **高特异性**：引物针对蕲蛇DNA高度保守区域设计，不与其他物种发生交叉反应。
5. **定性与定量兼用**：既可用于物种鉴定，也可通过标准曲线进行精确定量，线性范围达5个数量级。
6. **规格充足**：本试剂盒可完成50次20μL体系的SYBR Green qPCR反应。
7. **适用范围**：本产品仅限科研使用。
---
三、试剂盒组成
| 产品组成 | 产品编号 | 规格容量 |
|----------------------------------|-------------|-------------|
| 2 × SYBR qPCR Mix | GZ020801 | 550 μL |
| DEPC-H₂O | GZ070401 | 1 mL |
| 荧光模板稀释液 | GZ070407 | 1 mL |
| 蕲蛇染料法 qPCR 引物混合液 | 14-99197yw | 260 μL |
| 蕲蛇染料法 qPCR 阳性对照（1×10⁸ 拷贝/μL）| 14-99197pc | 50 μL |
---
四、储存条件
- 本品需在 **-20℃** 条件下保存，有效期为一年。
- 运输过程中需保持低温。
- **请注意**：阳性对照应单独存放，避免交叉污染。
---
五、实验操作流程
1. DNA 提取（样本制备区）
- 可使用自选方法或市售DNA提取试剂盒提取样本DNA。
- 建议设置 **样品制备阳性对照（PC）** 与 **样品制备阴性对照（NC）**：
- PC：取10 μL 阳性对照1000倍稀释液，加水至样本体积；
- NC：直接使用等体积纯水。
2. 标准曲线制备（样本制备区）
> 注意：阳性对照浓度高，请在独立区域操作，严防气溶胶污染。
1. 准备6支离心管，标记为2–7号。
2. 每管加入45 μL荧光模板稀释液。
3. 取5 μL阳性对照（1×10⁸ 拷贝/μL）加入7号管，混匀得1×10⁷ 拷贝/μL标准品。
4. 依次进行10倍梯度稀释，得到1×10²~1×10⁷ 拷贝/μL的标准曲线样品。
5. 若仅做定性检测，可将阳性对照稀释至1×10⁵ 拷贝/μL备用。
3. 反应体系配制（试剂准备区）
按下表在各qPCR管中加入相应试剂（单位：μL）：
| 成分 | 样品管（×N） | 阴性对照 | 阳性对照 |
|-------------------------|--------------|----------|----------|
| 2 × SYBR qPCR Mix | 10 | 10 | 10 |
| 蕲蛇qPCR引物混合液 | 5 | 5 | 5 |
| 50× ROX Reference Dye* | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| DEPC-H₂O（如需要） | 补至20 μL |
> *ROX使用说明：
> - **ROX I** 适用机型：ABI Prism 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, StepOne 等；
> - **ROX II** 适用机型：ABI 7500/7500Fast, ViiA7, Stratagene MX 系列；
> - **无需ROX** 的机型：Bio-Rad CFX 系列, Roche LightCycler 480, Qiagen Rotor-Gene 等（用DEPC-H₂O补足体积）。
配制完成后，将反应管转移至模板添加区。
4. 添加模板（模板添加区）
- 阴性对照管：加入 5 μL DEPC-H₂O
- 样品管：分别加入 5 μL 待测DNA
- 阳性对照管：加入 5 μL 稀释后的阳性对照（1×10⁵ 拷贝/μL）
- 短暂离心使液体沉至管底。
5. 扩增程序设置（扩增及产物分析区）
将反应管置于实时荧光定量PCR仪中，设置如下程序：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 信号采集 |
|------------------|------|----------|-------------------|
| 预变性 | 95℃ | 3 min | 否 |
| PCR 扩增（40 循环）| 95℃ | 15 sec | 否 |
| | 65℃ | 20 sec | **SYBR 通道采集** |
| 熔解曲线分析 | 按仪器预设程序执行 | | |
---
六、结果分析说明
1. 定量分析（标准曲线法）
以阳性对照的log₁₀拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品Ct值推算其DNA浓度。
2. 定性分析（无标准曲线）
- **阳性对照**：Ct < 28，扩增曲线呈典型S型。
- **阴性对照**：Ct > 30 或无Ct值，熔解曲线Tm值与阳性对照差异≥2℃。
- **样本判断标准**：
- **阳性**：Ct ≤ 30，扩增曲线呈典型指数增长，且熔解曲线峰值与阳性对照一致；
- **阴性**：Ct > 30 或无Ct值，或熔解曲线Tm值与目标片段差异≥2℃。
---
七、注意事项
- 实验操作需分区进行，防止污染。
- 使用前请充分混匀各组分，避免反复冻融。
- 熔解曲线分析是判断特异性的重要依据，请务必执行。
---
八、生产信息
**生产商：上海雅吉生物科技有限公司**
**官网：www.yajimall.com**
**服务支持：提供技术咨询与售后服务**
Agkistrodon蕲蛇染料法PCR鉴定试剂盒
