**Human Parainfluenza Virus 3 (HPIV-3) Probe RT-qPCR Kit**
**使用手册 V3.1**
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一、产品介绍
人副流感病毒（Human Parainfluenza Virus, HPIV）是引起儿童及成人呼吸道感染的常见病原体之一，其中人副流感病毒3型（HPIV-3）在临床上尤为常见，常导致婴幼儿及免疫低下人群发生严重的下呼吸道感染，如肺炎、支气管炎和细支气管炎。其致病性仅次于呼吸道合胞病毒（RSV），且易引起反复感染，对公共卫生构成一定威胁。
为满足科研工作中对 HPIV-3 快速、准确检测的需求，上海雅吉生物科技有限公司开发了本款 **人副流感病毒 3 型探针法荧光定量 RT-PCR 试剂盒**。该试剂盒基于探针法荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，具有高灵敏度、高特异性和操作简便等特点，适用于临床样本、病毒培养物及环境样本中 HPIV-3 RNA 的定性与定量检测。
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二、产品特点
1. **即开即用**：用户只需提供提取的样品 RNA 模板，试剂盒内含所有 RT-qPCR 所需组分，操作简便。
2. **高灵敏度**：经过优化的引物与探针组合，可检测低拷贝数的病毒 RNA，灵敏度显著。
3. **内置阳性对照**：提供已知浓度的阳性对照，便于用户验证实验流程，识别假阴性结果。
4. **高特异性**：引物与探针针对 HPIV-3 RNA 高度保守区域设计，不与其它呼吸道病毒发生交叉反应。
5. **定性与定量兼用**：既可用于判断样本中是否含有 HPIV-3（定性），也可通过标准曲线进行精确定量，线性范围达 5 个数量级。
6. **规格充足**：本试剂盒可完成 50 次 20 μL 体系的荧光定量 RT-PCR 反应。
7. **适用范围**：本产品仅限于科研用途。
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三、试剂盒组成
| 产品组成 | 产品编号 | 规格容量 |
|-----------------------------------|---------------|-------------|
| 2 × OneStep Probe Mix | GZ021101a | 550 μL |
| OneStep Probe Enzyme Mix | GZ021102b | 110 μL |
| DEPC-H₂O | GZ070401 | 1 mL |
| 荧光模板稀释液 | GZ070407 | 1 mL |
| HPIV-3 RT-qPCR 引物-探针混合液 | 15-88030yp | 160 μL |
| HPIV-3 RT-qPCR 阳性对照 (1×10⁸ 拷贝/μL) | 15-88030pc | 50 μL |
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四、储存条件
- 本品需在 **-20℃** 条件下保存，有效期为一年。
- 运输过程中需保持低温。
- **请注意**：阳性对照应单独存放，避免污染其他试剂。
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五、实验操作流程
1. RNA 提取（样本制备区）
推荐使用配套的 **病毒基因组 DNA/RNA 提取试剂盒（Cat: GZ010702-50）** 或其他市售核酸提取试剂盒进行样本 RNA 的提取。提取后的 RNA 应尽快用于实验，或于 -80℃ 保存。
2. 标准曲线制备（样本制备区）
> 注意：阳性对照浓度高，稀释操作应在独立区域进行，严防污染。
1. 取 6 支洁净离心管，标记为 2–7 号。
2. 每管预先加入 45 μL 荧光模板稀释液。
3. 取 5 μL 阳性对照（1×10⁸ 拷贝/μL）加入 7 号管，充分混匀，得 1×10⁷ 拷贝/μL 标准品。
4. 依次进行 10 倍梯度稀释，直至 2 号管，得到 1×10²~1×10⁷ 拷贝/μL 的标准曲线样品。
5. 若仅做定性检测，可将阳性对照稀释至 1×10⁵ 拷贝/μL 作为阳性参考。
3. 反应体系配制（试剂准备区）
按下表在各 qPCR 管中加入相应试剂（单位：μL）：
| 成分 | 样品管（×N） | 阴性对照 | 阳性对照 |
|-------------------------------|--------------|----------|----------|
| 2 × OneStep Probe Mix | 10 | 10 | 10 |
| OneStep Probe Enzyme Mix | 2 | 2 | 2 |
| HPIV-3 引物-探针混合液 | 3 | 3 | 3 |
配制完成后，将反应管转移至模板添加区。
4. 加模板（模板添加区）
- 阴性对照管：加入 5 μL DEPC-H₂O
- 样品管：分别加入 5 μL 待测 RNA
- 阳性对照管：加入 5 μL 稀释后的阳性对照（1×10⁵ 拷贝/μL）
- 短暂离心使液体积聚于管底。
#### 5. 扩增程序设置（扩增及产物分析区）
将反应管置于实时荧光定量 PCR 仪中，设置如下程序：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 信号采集 |
|--------------|------|----------|----------|
| 逆转录 | 50℃ | 20 min | 否 |
| 预变性 | 95℃ | 10 min | 否 |
| PCR 扩增（45 循环） | 95℃ | 15 sec | 否 |
| | 60℃ | 60 sec | **FAM 通道** |
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### 六、结果判读说明
#### 1. 定量分析（标准曲线法）
以阳性对照的 log₁₀ 拷贝数为横坐标，Ct 值为纵坐标绘制标准曲线。根据待测样本的 Ct 值，推算其 RNA 浓度。
2. 定性分析（无标准曲线）
- **阳性对照**：Ct < 30，扩增曲线呈典型 S 型。
- **阴性对照**：Ct > 40 或无 Ct 值，无典型扩增。
- **样本判断标准**：
- **阳性**：Ct < 38，曲线呈明显指数增长；
- **阴性**：Ct > 40 或无 Ct 值；
- **可疑**：Ct 介于 38–40，需复检。复检后仍在此范围且曲线典型者判为阳性，否则为阴性。
