一、实验流程
1. 靶点设计与gRNA验证
-
gRNA设计
-
使用在线工具（如CRISPR Design Tool 或 CHOPCHOP）针对 RNASE13 的外显子区域（尤其是 5'端首个功能域外显子）设计 2-3条高效gRNA。
-
优先选择 高On-target评分（>80）且低Off-target风险 的靶点。
-
-
gRNA活性验证
-
通过 T7E1酶切实验 或 Sanger测序（TA克隆） 在细胞中预验证编辑效率。
-
2. 递送系统选择
| 方法 | 适用细胞类型 | 优势 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 电转RNP | 易转染细胞（如HEK293） | 脱靶率低，效率高（>70%） | 需优化电转条件 |
| 慢病毒 | 难转染细胞（如原代细胞） | 感染效率高，可稳定整合 | 脱靶风险高，周期长 |
| 脂质体转染 | 贴壁细胞系 | 操作简单 | 效率低（30-50%） |
3. 基因编辑与筛选
-
转染/感染后48小时：通过 流式分选（GFP标记） 或 嘌呤霉素筛选（需载体含抗性基因） 富集编辑细胞。
-
单克隆分离：采用 有限稀释法 或 克隆环法 获取单克隆细胞株。
4. 敲除验证
-
基因组水平：
-
PCR扩增靶区域 → Sanger测序 确认插入/缺失（Indel）。
-
二代测序（NGS） 分析大片段缺失（若使用双gRNA策略）。
-
-
蛋白水平：
-
Western Blot 使用 RNASE13特异性抗体（推荐Abcam #ab12345）检测蛋白敲除。
-
注意：若检测到残留蛋白，可能是 截短型异构体，需设计靶向 多个外显子 的gRNA。
-
二、关键问题与解决方案
1. 敲除效率低
-
优化方案：
-
更换 高活性gRNA 或 双gRNA共转染。
-
使用 Cas9增效剂（如Alt-R S.p. HiFi Cas9） 提高编辑效率。
-
2. 脱靶效应
-
控制措施：
-
选择 低脱靶gRNA（通过工具预测如CCTOP）。
-
采用 Cas9-D10A切口酶（Nickase） 双靶点策略降低风险。
-
3. 细胞生长异常
-
可能原因：
-
RNASE13敲除影响细胞增殖（需验证是否为基因功能相关）。
-
解决方案：改用 条件性敲除（如Cre-loxP系统） 或 可诱导型Cas9。
-
