一、实验材料
1. 细胞系
-
目标细胞（如HEK293、SH-SY5Y、原代神经元等，根据研究需求选择）。
-
培养条件：DMEM/RPMI-1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep（依细胞类型调整）。
2. CRISPR-Cas9 基因编辑工具
-
sgRNA 设计（靶向SORCS1基因）：
-
选择 N端外显子（如Exon 2-4），以提高敲除效率。
-
使用在线工具（如CRISPR Design Tool 或 CHOPCHOP）设计 2-3条高效sgRNA。
-
示例sgRNA靶序列（人源SORCS1）：
5'-GACCTGCGCTTCGAGATCGG-3'（Exon 2） 5'-GCTGGTACCGAGATCGCCGA-3'（Exon 3）
-
-
CRISPR载体：
-
Cas9 + sgRNA 质粒（如pSpCas9(BB)-2A-Puro, Addgene #62988）。
-
慢病毒/腺病毒载体（适用于难转染细胞）。
-
HDR修复模板（可选，用于引入筛选标记，如嘌呤霉素抗性基因）。
-
3. 试剂
-
转染试剂（Lipofectamine 3000、PEI等）。
-
嘌呤霉素（Puromycin, 1-5 μg/mL，用于筛选）。
-
T7E1 或 Surveyor 核酸酶（用于突变检测）。
-
基因组DNA提取试剂盒（如Qiagen DNeasy）。
-
SORCS1抗体（WB验证用，如Santa Cruz sc-365605）。
二、实验步骤
1. sgRNA 设计与载体构建
-
设计sgRNA：
-
在 SORCS1 的编码区（CDS） 选择 2-3个靶点，避免脱靶（用 BLAST 验证）。
-
合成sgRNA oligos，克隆至 pSpCas9(BB)-2A-Puro 载体（或购买商业化的sgRNA质粒）。
-
-
转染质粒：
-
将 Cas9-sgRNA 质粒 转染至目标细胞（Lipofectamine 3000 或电转）。
-
设置 空载体对照组（仅Cas9，无sgRNA）。
-
-
筛选阳性细胞（48-72h后）：
-
加入 嘌呤霉素（1-5 μg/mL） 筛选 3-5天，杀死未转染细胞。
-
收集存活细胞，进行单克隆化（有限稀释法或流式分选）。
-
2. 单克隆细胞筛选
-
有限稀释法：
-
将转染后的细胞稀释至 0.5-1个细胞/孔，接种于96孔板。
-
培养 2-3周，待单克隆形成后扩增。
-
-
PCR + T7E1/Surveyor 检测：
-
提取单克隆细胞基因组DNA。
-
PCR扩增 SORCS1 靶区域（引物设计需跨sgRNA切割位点）。
-
用 T7E1 核酸酶 消化PCR产物，跑胶检测 indel突变（出现额外条带说明编辑成功）。
-
-
测序验证：
-
对PCR产物进行 Sanger测序，分析突变类型（移码突变、缺失等）。
-
3. Western Blot 验证敲除效率
-
裂解细胞，提取总蛋白。
-
SDS-PAGE 电泳，转膜至PVDF。
-
一抗孵育（抗SORCS1，如1:1000稀释）。
-
二抗孵育（HRP标记，如1:5000）。
-
ECL显影，观察 SORCS1蛋白是否消失（与对照组比较）。
4. 功能实验（可选）
-
表型分析：
-
若研究 神经退行性疾病，可检测 Aβ分泌、tau磷酸化。
-
若研究 代谢疾病，可检测 胰岛素信号通路（如AKT磷酸化）。
-
-
RNA-seq 或 qPCR：分析SORCS1下游基因表达变化。
三、注意事项
-
脱靶效应：
-
使用 双切口酶（Cas9n） 或 高保真Cas9（如HiFi Cas9） 降低脱靶风险。
-
推荐 全基因组测序（WGS） 或 脱靶预测软件（如COSMID） 分析。
-
-
单克隆筛选：
-
确保 单克隆来源，避免混合细胞干扰实验结果。
-
-
备份细胞：
-
冻存 多个单克隆，防止实验失败。
-
四、常见问题
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 敲除效率低 | sgRNA设计不佳 | 重新设计sgRNA，优化转染条件 |
| WB仍有蛋白残留 | 未完全敲除 | 筛选纯合子克隆或尝试双sgRNA |
| 细胞死亡过多 | 嘌呤霉素浓度过高 | 降低浓度（1-2 μg/mL） |
